少腹逐瘀湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠異位內(nèi)膜HIF-1α表達(dá)的影響※

曹　穎　白素芬　杜晨光　謝　偉　劉慧娟

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMT） 是一種子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)種植于子宮腔以外的雌激素依賴性疾病。在育齡期女性中的發(fā)病率為10%，在不孕女性中的發(fā)病率高達(dá)30%～45%[1]。主要表現(xiàn)為痛經(jīng)、盆腔痛及不孕，嚴(yán)重困擾著處于黃金時(shí)期的部分女性。根據(jù)被絕大多數(shù)學(xué)者所接受的異位種植學(xué)說(shuō)，EMT源于脫落的內(nèi)膜隨經(jīng)血逆流進(jìn)入腹腔，經(jīng)“黏附-侵襲-血管形成”三步曲種植于腹腔或其他臟器表面[2]。經(jīng)期螺旋小動(dòng)脈收縮，子宮內(nèi)膜處于缺氧狀態(tài)[3]，內(nèi)膜碎片進(jìn)入腹腔后，在血管生成前，內(nèi)膜缺氧將持續(xù)存在。而適度的缺氧恰恰能夠減少內(nèi)膜細(xì)胞凋亡，從而有利于內(nèi)膜異位種植[4]。缺氧和缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α） 已成為內(nèi)異癥的研究熱點(diǎn)。在內(nèi)異癥病理標(biāo)本中，HIF-1α表達(dá)明顯增加[5-6]。研究表明，在缺氧環(huán)境中HIF-1α的穩(wěn)定表達(dá)，提高了異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的侵襲能力[7]，促進(jìn)了細(xì)胞中血管生成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[8]。而侵襲及血管生成是異位內(nèi)膜種植生長(zhǎng)的必要條件，由此說(shuō)明HIF-1α在EMT的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

目前，中醫(yī)藥療法被廣泛應(yīng)用于內(nèi)異癥的治療。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，內(nèi)異癥屬中醫(yī)“血瘀證”范疇，寒凝血瘀是內(nèi)異癥最常見(jiàn)的證型之一[9]。以活血化瘀、溫經(jīng)止痛立法的經(jīng)典名方少腹逐瘀湯是治療寒凝血瘀型內(nèi)異癥的常用方劑。為進(jìn)一步明確少腹逐瘀湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的治療作用及其療效機(jī)制是否與改善了異位病灶的缺氧狀態(tài)有關(guān)，本研究通過(guò)建立自體移植子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型，觀察少腹逐瘀湯治療對(duì)異位病灶體積及HIF-α表達(dá)的影響，為其臨床應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)室研究證據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠50只，雌性，體質(zhì)量（200±20） g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-（軍） 2014-0001。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 少腹逐瘀湯：根據(jù)王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》原方所載的藥味及配方比例，處方：當(dāng)歸9 g，生蒲黃9 g，五靈脂6 g，赤芍6 g，小茴香3 g，醋延胡索3 g，沒(méi)藥3 g，川芎3 g，肉桂3 g，炮姜0.6 g。以上中藥購(gòu)于北京同仁堂唐山連鎖藥店有限公司。采用傳統(tǒng)煎煮方法，除肉桂外其他藥物加水300 mL浸泡1 h，煮沸后，文火煎煮60 min；肉桂后下，煎煮20 min；濾出藥液，濃縮至1 g/mL。兔單克隆HIF-1α抗體 （ab463，美國(guó)abcam公司），小鼠單抗GAPDH抗體（sc32233，美國(guó)Santa cruz）。1.2動(dòng)物造模及分組 50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d，每日陰道涂片檢查動(dòng)情周期。選擇連續(xù)有2個(gè)正常動(dòng)情周期的大鼠，共計(jì)48只，于動(dòng)情期造模[10]。造模前24 h予戊酸雌二醇0.2 mg/只灌胃。2%戊巴比妥鈉按40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。在無(wú)菌條件下，以尿道口上端約1 cm處為切入點(diǎn)，沿腹中線切開(kāi)1.5～2 cm的縱形切口，進(jìn)入腹腔。結(jié)扎右側(cè)子宮，取子宮中間段約1.5 cm，縱形剪開(kāi)宮腔，剪取5 mm×5 mm大小的子宮組織，生理鹽水反復(fù)沖洗。將子宮內(nèi)膜面貼向左側(cè)腹膜血管豐富處，用5-0非吸收性縫合線縫合組織四角，逐層關(guān)腹。術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素鈉15萬(wàn)U/只。術(shù)后第10天起灌胃戊酸雌二醇0.02 mg/只，連續(xù)5 d。造模后第28天，陸續(xù)選取動(dòng)情期大鼠剖腹檢查確定造模是否成功。若移植的子宮內(nèi)膜體積增大，呈透明的結(jié)節(jié)狀或囊狀，內(nèi)有液體積聚，表面有結(jié)締組織覆蓋及血管形成，則認(rèn)為造模成功。造模成功的大鼠共計(jì)38只，用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組及治療組，每組19只。治療組給予少腹逐瘀湯灌胃，按人體正常給藥量46.6 g/d，根據(jù)大鼠體表面積換算為大鼠給藥量，模型組灌胃等體積生理鹽水。每周根據(jù)大鼠體重變化調(diào)整灌胃量，連續(xù)灌胃4周。藥物干預(yù)期間，模型組有1只大鼠死于灌胃意外，治療組有1只大鼠因咬傷死亡。

1.3指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1異位病灶體積 于造模后第4周、給藥后第4周行剖腹探查，用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄異位病灶的長(zhǎng)、寬、高，計(jì)算病灶體積V=0.52×長(zhǎng)×寬×高[11]。

1.3.2大鼠異位內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)觀察 將異位內(nèi)膜組織用10%甲醛溶液固定48 h，經(jīng)梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察異位內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3.3Western blot法檢測(cè)HIF-1α表達(dá) 異位病灶取材后提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，每泳道上樣蛋白50μg，電泳并轉(zhuǎn)膜。將膜置于1∶200 HIF-1α一抗中，4℃孵育過(guò)夜。二抗羊抗兔IgG 37℃孵育2 h，顯色1 min，Image J軟件測(cè)定條帶光密度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述；符合正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1少腹逐瘀湯對(duì)異位病灶體積及形態(tài)學(xué)的影響 治療前，模型組與治療組異位病灶體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)4周藥物干預(yù)后，模型組異位病灶體積較治療前增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療組異位病灶體積較治療前縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；治療組異位病灶體積小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。與模型組相比，治療組異位內(nèi)膜中腺體數(shù)量減少，腺上皮細(xì)胞數(shù)量減少，間質(zhì)細(xì)胞排列疏松，見(jiàn)圖1。

表1　少腹逐瘀湯治療前后異位病灶體積變化　(x±s，mm3)

圖1　模型組與治療組的異位內(nèi)膜組織HE染色（×100）

2.2少腹逐瘀湯對(duì)異位子宮內(nèi)膜組織中HIF-1α蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，治療組HIF-1α表達(dá)下調(diào)，是模型組的58.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2　模型組與治療組異位子宮內(nèi)膜組織中HIF-1α蛋白表達(dá)

3　討論

經(jīng)典的內(nèi)異癥病因?qū)W說(shuō)認(rèn)為經(jīng)血逆流是內(nèi)異癥的起因。子宮內(nèi)膜碎片隨經(jīng)血進(jìn)入腹腔時(shí)，必然要經(jīng)歷缺血、缺氧的改變。為了適應(yīng)低氧環(huán)境，細(xì)胞通過(guò)上調(diào)或下調(diào)幾百種蛋白編碼基因的表達(dá)創(chuàng)造出了精妙而復(fù)雜的適應(yīng)機(jī)制[12]，如改變糖代謝，細(xì)胞凋亡、增殖、侵襲，血管生成等。缺氧誘導(dǎo)因子（HIFs）是細(xì)胞應(yīng)對(duì)缺氧環(huán)境最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，HIF-1是HIFs中最具代表性的因子，幾乎在各種細(xì)胞均有表達(dá)。由α、β兩個(gè)亞基形成異二聚體結(jié)構(gòu)，可以激活近百種靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞在缺氧應(yīng)激下的生物學(xué)行為。其中β亞基不受氧環(huán)境影響而穩(wěn)定表達(dá)；α亞基在常氧環(huán)境中被泛素蛋白酶體迅速降解，在低氧環(huán)境中才能穩(wěn)定表達(dá)。因此HIF-1的活性主要依賴于α亞基。低氧條件下，穩(wěn)定表達(dá)的HIF-1α發(fā)生核轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與HIF-1β形成二聚體，結(jié)合于靶基因啟動(dòng)子區(qū)的缺氧反應(yīng)元件（Hypoxia response element，HRE），形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄[13-14]。有研究發(fā)現(xiàn)，異位病灶間質(zhì)細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞[15]。而異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞中HIF-1α的穩(wěn)定表達(dá)，能夠上調(diào)一系列促進(jìn)血管生成的基因如血管生成因子（Vascular endothelial growth factor， VEGF）、瘦素，同時(shí)后者又能夠促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞增殖[15]。此外HIF-1α還能夠上調(diào)環(huán)氧合酶-2（Cyclooxygenase-2， COX-2） 的表達(dá)，COX-2是催化花生四希酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶[16]。因此，HIF-1α表達(dá)上調(diào)與內(nèi)異癥病灶的持續(xù)炎癥狀態(tài)密切相關(guān)。異位病灶局部微環(huán)境中前列腺素E2的增多，又可以改變多種類固醇合成基因的表達(dá)，從而更有效地促進(jìn)細(xì)胞中的膽固醇轉(zhuǎn)化為雌二醇[17]。由此可知，HIF-1α又可能參與了異位病灶局部雌激素的合成。綜上所述，HIF-1α可能通過(guò)調(diào)控血管生成、雌激素代謝、炎癥因子表達(dá)等多種途徑參與了內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，是治療內(nèi)異癥的潛在靶標(biāo)。

我們的研究表明，少腹逐瘀湯能夠減少異位病灶局部HIF-1α的蛋白表達(dá)，這可能是其治療內(nèi)異癥的作用機(jī)制之一。然而少腹逐瘀湯下調(diào)HIF-1α表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚，可能與活血化瘀藥物改善了病灶局部微循環(huán)狀態(tài)有關(guān)。從形態(tài)上看，異位病灶血管呈現(xiàn)密集的網(wǎng)狀分支特征，與腫瘤血管的分布特征類似，這樣的血管分布不利于血流灌注。在病灶發(fā)展過(guò)程中，缺氧狀態(tài)無(wú)法徹底改善。病灶局部VEGF、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF） 的高表達(dá)同時(shí)也提示局部微血管的滲透性增加[18]，從血管滲出的炎細(xì)胞局部浸潤(rùn)，將進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞增殖加重氧耗。如此看來(lái)血管生成似乎并不能夠完全解決組織缺氧的問(wèn)題，反而形成了“血管生成-炎細(xì)胞浸潤(rùn)-細(xì)胞增殖-耗氧量增加”的惡性循環(huán)。這與中醫(yī)理論對(duì)于EMT屬“血瘀證”的病機(jī)認(rèn)識(shí)不謀而合。少腹逐瘀湯是否通過(guò)改善病灶局部微循環(huán)，改變了病灶的缺氧環(huán)境，從而減少了HIF-1α的表達(dá)，將是我們進(jìn)一步研究的重要方向。

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