云芝發酵液中α-半乳糖苷酶酶學特性的研究*

杜　芳，雷　萍，吳亞召，張文雋，王賀祥

（1.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043；2.農業生物技術國家重點實驗室，中國農業大學生物學院，北京 100193）

α-半乳糖苷酶 （α-galactosidase，EC 3.2.1.22）也稱蜜二糖酶，是1種外切水解酶，可催化水解非還原性末端以α-1,6鍵結合的半乳糖苷化合物[1]，可用于水解豆科植物中α-半乳糖苷低聚糖，消除豆類制品中由此引起的抗營養因子，促進其他營養物質的消化和吸收，目前廣泛應用于飼料業、食品業、醫藥工業等領域[2]。α-半乳糖苷酶大量分布于植物、微生物和動物中，由于來源不同其理化性質差異也較大[3]。因此，為保證獲得高活性和高穩定性的α-半乳糖苷酶，需要研究一些外在因素對該酶的影響，如最適pH和最適反應溫度等，并盡量提高酶活穩定性，確保后期應用到食品、飼料等領域中時可以穩定食用。本文研究云芝（Trametes versicolor） 發酵液中α-半乳糖苷酶的理化性質，并篩選提高其酶活穩定性的共溶劑，為該酶制劑的有效生產和應用提供理論依據。

1　材料和方法

1.1　菌種與試劑

云芝菌種來自于陜西省微生物研究所微生物資源中心第三研究室；底物對硝基苯基α-D-吡喃半乳糖苷（pNPG） 購自Sigma公司（N0877）；其它試劑均為分析純。

1.2　培養基

斜面培養基：綜合PDA；種子培養基：豆粨粉2%、KH2PO40.1%；發酵培養基：豆粨粉2%、半乳糖1%、MgSO40.1%、KH2PO40.05%。

1.3　云芝液體發酵

1.3.1液體種子培養

250mL三角瓶裝入50mL液體種子培養基，加入10?！?5粒玻璃珠，高壓滅菌后接入云芝斜面菌種，于26℃、180 r·min-1振蕩培養5 d，獲得云芝液體菌種。

1.3.2液體發酵培養

250mL三角瓶裝入50 mL液體發酵培養基，高壓滅菌后接入3%（v·v-1）的云芝液體菌種，于26℃、180 r·min-1振蕩培養7 d，獲得云芝發酵液。

1.4　α-半乳糖苷酶活性的測定

1.4.1粗酶液的制備

將云芝發酵液用高速冷凍離心機離心10 min得上清液，發酵菌絲球經研磨后低溫抽提2 h，離心后得上清液，將2次離心獲得的上清液合并即為粗酶液。

1.4.2酶活測定

吸取0.1mL適當稀釋后的粗酶液，再加入濃度為10mmol·L-1的底物對硝基苯基α-D-吡喃半乳糖苷0.1 mL，于40℃恒溫振蕩反應10 min，加入0.8 mL的Na2CO3溶液振蕩混勻，終止酶反應，于波長405 nm處測定吸光值。

酶活力單位定義：在一定條件下，每分鐘生成1μmol對硝基苯酚的酶量為1個酶活力單位（U）[4]。

1.5　α-半乳糖苷酶理化性質的測定

1.5.1最適pH和pH穩定性的測定

最適pH的測定：配制不同pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH分別為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0、8.0），測定α-半乳糖苷酶在不同pH緩沖液中的酶活，將酶活力最高值計為100%，計算各pH下的α-半乳糖苷酶相對酶活，并繪制酶活變化曲線。

pH穩定性的測定：將適當稀釋的酶液與不同pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液在常溫下孵育2 h，測定α-半乳糖苷酶活性，測得的最高酶活值計為100%，計算不同pH下的酶活存留率。

1.5.2最適反應溫度和溫度穩定性的測定

最適反應溫度的測定：在不同溫度20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下反應，然后測定α-半乳糖苷酶活性，測得的最高酶活值計為100%，計算不同反應溫度下α-半乳糖苷酶的相對酶活，并繪制酶活變化曲線。

溫度穩定性的測定：將適當稀釋的酶液分別在不同溫度下孵育2 h，在最適反應溫度下進行酶活性測定，以未保溫（4℃）時測得的酶活值計為100%，計算不同反應溫度下的酶活存留率。

1.5.3金屬離子對α-半乳糖苷酶活性的影響

使用去離子水配制 20 mmol·L-1的 K+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、Cd2+、Mn2+、Hg2+、Pb2+、Zn2+、Fe2+、Al3+和Fe3+金屬離子溶液，再與α-半乳糖苷酶溶液混合，使各金屬離子溶液終濃度分別達到1.25 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1、5 mmol·L-1和 10 mmol·L-1，于 4℃下孵育2 h，然后測定酶活性，以去離子水與α-半乳糖苷酶溶液混合測得的酶活計為100%，計算各種金屬離子溶液中α-半乳糖苷酶的相對酶活。

1.5.4不同保護劑對α-半乳糖苷酶的影響

以一定比例將不同類型的保護劑與α-半乳糖苷酶溶液混合，60℃水浴1 h，取出后立即冰浴，稀釋一定倍數測定酶活力，以未保溫（4℃）、未加保護劑測得的酶活值計為100%，計算不同保護劑下的酶活存留率。

2　結果與分析

2.1　pH對云芝α-半乳糖苷酶活性的影響

pH對云芝α-半乳糖苷酶活性的影響結果，見圖1。

從圖1A中可以看出，當緩沖液pH為3.0時α-半乳糖苷酶活性最高，以此計為100%；pH為2.0時α-半乳糖苷酶相對酶活性為60%，此時并未失活；隨著緩沖液pH的不斷升高，α-半乳糖苷酶活性持續降低，當緩沖液pH為7.0時，相對酶活降低為10%，pH8.0時幾乎檢測不到酶活。從圖1B中可以看出，α-半乳糖苷酶溶液在緩沖液pH2.0～5.0范圍內酶活存留率依然在80%以上，說明α-半乳糖苷酶極耐酸性。因此，云芝發酵液中α-半乳糖苷酶的最適pH為3.0，在酸性條件下酶活穩定性最好。

圖1　云芝α-半乳糖苷酶pH的特性Fig.1　pH properties ofα-galactosidase from Trametes versicolor

2.2　溫度對云芝α-半乳糖苷酶活性的影響

反應溫度對云芝α-半乳糖苷酶活性的影響結果見圖2。

圖2　云芝α-半乳糖苷酶溫度的特性Fig.2　Temperature properties ofα-galactosidase from Trametes versicolor

從圖2C可以看出，隨著反應溫度的逐漸升高，α-半乳糖苷酶活性持續增加，在60℃時酶活達到最大值，以此計為100%；隨著反應溫度升至70℃時，α-半乳糖苷酶相對酶活降低為60%，當溫度為80℃時蛋白質發生了變性，此時幾乎檢測不到酶活。

從圖2D中可以看出，當溫度低于50℃時α-半乳糖苷酶活性比較穩定，相對酶活在70%以上；隨著溫度的升高酶活性有降低的趨勢，在60℃時酶活性迅速降至5%，反應溫度為70℃時α-半乳糖苷酶已失去活性。因此，云芝發酵液中α-半乳糖苷酶的最適反應溫度為60℃，而且在較大溫度范圍內酶活性依然保持穩定，說明該酶耐熱性較好。

2.3　金屬離子對云芝α-半乳糖苷酶活性的影響

不同濃度的不同種類金屬離子對云芝α-半乳糖苷酶活性的影響結果見表1，以未加金屬離子測得的酶活計為100%。

從表1中可以看出，Fe3+對酶活性的抑制作用最強，當離子濃度為10 mmol·L-1時幾乎檢測不到酶活，Fe3+濃度降低至1.25 mmol·L-1時酶活性才恢復到68%；Pb2+對酶活性的抑制作用也較強，當其濃度為10mmol·L-1時酶活性降低至13%，隨著Pb2+濃度的逐漸減小，對酶活的抑制作用也隨之降低；Cd2+、Cu2+、Hg2+對α-半乳糖苷酶活性也有一定的抑制作用，酶活性降低20%～50%，Ca2+、Mg2+、Zn2+和Fe2+等離子對α-半乳糖苷酶活性影響不明顯。

2.4　不同保護劑對云芝α-半乳糖苷酶熱穩定性影響

不同保護劑對云芝α-半乳糖苷酶活性的影響結果見表2。

表1　金屬離子對α-半乳糖苷酶活性的影響Tab.1　Effect ofmetal ion onα-galactosidase

從表2中可以看出，除添加山梨酸鉀不利于α-半乳糖苷酶的熱穩定性以外，其它保護劑均對α-半乳糖苷酶熱穩定性有較好的保護效果，酶活保留率均高于對照組（54.18%）；其中保護效果最好的是甘露醇，其次是海藻糖、蜜二糖、棉籽糖、L-半胱氨酸、甘油和黃原膠等。

從表2中還可以看出，同一種保護劑不同濃度對α-半乳糖苷酶熱穩定性的保護作用也不同，添加濃度2 mmol·L-1的甘露醇、海藻糖、乳糖、抗壞血酸、棉籽糖、蜜二糖、L-半胱氨酸、CaCl2·2H2O、白蛋白、NaCl和明膠，酶活保留率高于添加濃度1 mmol·L-1；添加濃度 1mmol·L-1巰基乙醇效果好于添加濃度2 mmol·L-1，添加10%甘油酶活保留率高于20%，其次是0.2%黃原膠、0.3%黃原膠。

3　討論

通過對云芝發酵液中α-半乳糖苷酶酶學性質的研究發現，α-半乳糖苷酶最適反應pH為3.0，并且極耐酸性，在pH2.0～5.0之間酶活性依然保持在80%以上；最適反應溫度為60℃，在低于60℃條件下該酶穩定性良好，但是隨著溫度上升至60℃，酶活性驟然降低，說明隨著溫度的升高，蛋白質已經開始變性喪失活性，但是在很大溫度范圍內（20℃～70℃）酶活性依然保持穩定，說明該酶是1種耐熱的α-半乳糖苷酶。

金屬離子對云芝α-半乳糖苷酶的影響結果顯示，Pb2+和Fe3+對其酶活性有較強的抑制作用，隨著金屬離子濃度的升高，抑制作用越來越明顯，Cd2+、Cu2+、Hg2+致使α-半乳糖苷酶活性降低20%～50%，其他金屬離子對該酶活性的抑制作用不明顯。

表2　不同保護劑對α-半乳糖苷酶熱穩定性的影響Tab.2　Effectof different protective agents on the thermostabilityofα-galactosidase

酶成品中常需要加入糖類、甘油、多元醇、氨基酸及其衍生物等共溶劑，以改變酶溶液的熱力學性質，提高酶的穩定性，保存酶活[5]。本文研究發現在云芝α-半乳糖苷酶溶液中加入幾種不同的共溶劑，對α-半乳糖苷酶熱穩定性都有較好的保護效果，其中效果最好的是甘露醇，其次是海藻糖、蜜二糖、棉籽糖、L-半胱氨酸、甘油和黃原膠等；不同濃度保護劑對α-半乳糖苷酶熱穩定性的保護作用不同，添加濃度2 mmol·L-1的甘露醇、海藻糖、乳糖、抗壞血酸、棉籽糖、蜜二糖、L-半胱氨酸、CaCl2·2H2O、白蛋白、NaCl和明膠，酶活保留率高于添加濃度 1 mmol·L-1；添加濃度 1 mmol·L-1巰基乙醇效果好于添加濃度2mmol·L-1，10%甘油酶活保留率高于20%，其次是0.2%黃原膠、0.3%黃原膠。保護云芝α-半乳糖苷酶穩定性的共溶劑的篩選，可為提高該酶生產和儲存中酶活穩定性提供一定的應用價值。

參考文獻：

[1]楊志強，師昆景，于鋒.飼用α-半乳糖苷酶酶活穩定性的研究[J].飼料工業，2011，32（14）：26-29.

[2]楊冠東，劉芳，李荷.α-半乳糖苷酶的研究進展概況[J].現代食品科技，2006，22（3）：275-279.

[3]趙晴瀟，魏群.產α-半乳糖苷酶菌株的篩選、酶學特性和固定化研究[J].東北電力大學學報，2015，35（3）：77-81.

[4]Rezessy-SzabóJM,Nguyen QD,Hoschke á,et al.A novel thermostableα-galactosidase from the thermophilic fungusThermomyces lanuginosusCBS 395.62/b:Purification and characterization[J].Biochimica Et Biophysica Acta General Subjects,2007,1770(1):55-62.

[5]蘇俊，張國政，劉忠華，等.蛋白質在分離純化中保持穩定的方法及應用[J].天津輕工業學院學報，2002（1）：21-24.