5-羥甲基胞嘧啶表達與黑素瘤侵襲、轉移、預后的相關性分析

王瑩　康曉靜　趙娟　梁俊琴　張德志　柴莉　王鵬　王唯嘉

830001烏魯木齊，新疆維吾爾自治區人民醫院皮膚性病科

研究表明，啟動子甲基化可通過滅活腫瘤抑制基因導致惡性腫瘤發生，而甲基化轉移酶可通過沉默腫瘤抑制基因使胞嘧啶發生甲基化而致病。5-羥甲基胞嘧啶（5?hmc）是5甲基胞嘧啶（5?mc）發生異常甲基化形成的一種重要的表觀遺傳學標記，參與多種生理及病理過程［1］。我們通過免疫組化技術檢測5?hmc在黑素瘤中的表達，探討5?hmc表達與黑素瘤臨床病理參數的關系，分析其臨床意義。

圖1　免疫組化檢測5-羥甲基胞嘧啶（5?hmc）表達（×100） 1A：黑素瘤組織表達5?hmc；1B：色素痣組織高表達5?hmc

表1　黑素瘤中5-羥甲基胞嘧啶表達與臨床病理特征的相關性

一、材料及方法

1.標本來源及臨床病理特征：選取新疆維吾爾自治區人民醫院病理科及皮膚科2004年1月至2015年12月病理確診為黑素瘤的石蠟包埋組織67份及色素痣石蠟包埋組織20份。67例黑素瘤患者均無家族史，發病年齡28～95（62.01±13.28）歲，其中20～40歲5例，41～50歲11例，51～60歲15例，61～70歲16例，71～95歲20例。維吾爾族36例（53.73%），漢族31例（46.27%）。男性37例（55.22%），女性30例（44.78%）。病程1個月至22年，中位病程31個月。18例（26.87%）發生淋巴結轉移，49例（73.13%）無淋巴結轉移。參照美國癌癥聯合會（AJCC）臨床分期基于病理對原發病灶的評估，將初診患者分為以下3期：Ⅱ期20例（29.85%），無區域及遠處淋巴結轉移；Ⅲ期6例（8.96%），有區域淋巴結轉移；Ⅳ期41例（61.20%），有遠處淋巴結轉移。Clark分級Ⅰ～Ⅲ級26例（38.81%），Ⅳ、Ⅴ級41例（61.19%）。67例患者中45例接受手術治療（包括局部腫瘤切除、截指/趾及擴大切除），22例因年齡等因素未接受手術治療。

2.主要試劑：一抗為兔抗人多克隆5?hmc特異性抗體，來自美國Active Motif公司，濃度為1∶500。鼠抗兔通用型二抗、二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑均為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。

3.免疫組化SP法檢測5?hmc的表達：將4%甲醛固定、石蠟包埋的黑素瘤或痣組織切片，常規烤片、脫蠟、水化；浸入0.01 mmol/L pH6.0的枸櫞酸鹽緩沖液內，熱抗原修復3 min；3%H2O2室溫孵育30 min；DAB顯色1 min左右；自來水沖洗，蘇木精復染，通透、脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。磷酸鹽緩沖液代替一抗作為空白對照。

4.結果判斷：5?hmc陽性染色為棕黃色顆粒，主要定位于細胞核。觀察全片，借助高分辨顯微鏡隨機選取不重疊的5個100倍視野，得出陽性細胞所占百分比。采用半定量積分法，對每張切片的陽性細胞率及陽性細胞著色強度進行分級計分。染色強度分為3級：無著色0分，淺著色1分，棕黃色2分；按陽性細胞的百分比分為4級：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。每張切片最后的得分即5?hmc表達水平為染色強度和陽性細胞百分比分級的乘積，≥3分是高表達，＜3分是低表達。

5.隨訪：對入選本研究的67例黑素瘤患者進行電話隨訪，生存期的計算自患者接受手術之日起至死亡或2016年12月31日末次隨訪日，至末次隨訪日仍存活者生存時間定為刪失值。

6.統計學方法：采用SPSS18.0統計軟件。采用卡方檢驗比較5?hmc在黑素瘤和色素痣組織中的表達率，并分析黑素瘤患者5?hmc表達水平與患者臨床病理特征的關系；計算不同組的生存率，應用Kaplan?Meier法繪制累計生存率曲線；利用Cox比例風險回歸模型進行單因素和多因素回歸分析。P＜0.05認為差異有統計學意義。

二、結果

1.5?hmc在黑素瘤及色素痣中的表達：見圖1。67例黑素瘤中，27例表達5?hmc，表達率為40.30%；42例（62.69%）為低表達，25例（37.31%）為高表達。20例色素痣組織中，15例表達5?hmc，表達率為75%。5?hmc在黑素瘤組中的表達率明顯低于色素痣組，差異有統計學意義（χ2=7.428，P=0.006）。

2.黑素瘤中5?hmc表達與臨床病理特征的關系：臨床分期較晚期黑素瘤組織中5?hmc表達水平明顯低于早期黑素瘤組織（χ2=4.416，P=0.036）。淋巴結轉移患者表達水平明顯低于無淋巴結轉移患者（χ2=5.902，P=0.015），且5?hmc表達水平隨黑素瘤組織Clark分級升高及浸潤深度加深而降低（χ2=4.828，P=0.028）。5?hmc表達水平在不同年齡、性別、民族黑素瘤患者之間分布差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

3.黑素瘤患者生存情況：67例患者均獲得完整隨訪記錄，隨訪時間［M（P25～P75）］為36（12～47）個月，隨訪期間死亡 14例，存活時間［M（P25～P75）］為32（11～ 38）個月。采用壽命表法計算1年、3年、5年生存率分別為79%、47%、32%，標準誤分別為0.008、0.010、0.011。發生淋巴結轉移、未行手術切除、5?hmc低水平表達、Clark分級較高、臨床分期較晚患者生存期明顯縮短。見圖2。

4.COX回歸分析結果：單因素回歸分析顯示，淋巴結轉移、Clark分級、臨床分期、5?hmc表達水平與黑素瘤預后相關，年齡、性別、民族與預后無關，見表2。將單因素分析中與預后不良有關指標納入模型進行多因素Cox回歸模型分析，結果顯示，遠處淋巴結轉移（P=0.01）、未手術切除（P=0.04）、5?hmc低水平表達（P=0.03）、Clark分級（P=0.03）、AJCC分期（P＜0.01）為預后不良的獨立影響因素，見表2。

三、討論

5?hmc是5?mc經DNA羥化酶家族成員TET（ten?eleven translocation）催化發生去甲基化生成。5?hmc作為DNA去甲基化的重要中間產物，僅存在于哺乳動物中［2?3］，在一系列惡性腫瘤中存在缺失表達［4?5］，提示5?hmc缺失是細胞分化和腫瘤進展過程中重要的表觀遺傳學事件之一。對黑素瘤及其他惡性腫瘤研究發現，TET家族酶表達減少可導致5?hmc缺失表達［5?6］。Lian等［7］運用DNA羥甲基化免疫共沉淀?芯片檢測技術檢測全基因組DNA羥甲基化狀態，發現在黑素瘤患者全基因組中，無論啟動子、外顯子、內含子還是基因間結構均存在5?hmc低表達。

研究顯示，黑素瘤患者存在大量基因位點的低甲基化以及特定基因和抑癌基因的高甲基化［8?9］，多基因位點的DNA異常甲基化可能作為黑素瘤與色素痣的診斷鑒別要點［9?10］。但目前仍未發現特征性的表觀遺傳修飾可作為分子學標記應用于黑素瘤惡性程度的診斷與評價。有學者通過建立動物模型，發現提高5?hmc表達可抑制黑素瘤生長并提高無瘤生存率，同時5?hmc在黑素瘤及色素痣中存在差異表達，提示5?hmc對黑素瘤可能具有一定診斷價值［7?8］。近來研究也證實，5?hmc對于黑素瘤診斷具有一定意義［11?13］。

我們采用免疫組化技術檢測5?hmc在黑素瘤中的表達，結果顯示，黑素瘤5?hmc表達陽性率為40.30%，明顯低于色素痣（75%）。而且隨著腫瘤浸潤程度加深及臨床進展，5?hmc表達水平逐漸下降。5?hmc總體表達水平與淋巴結轉移、Clark分級、AJCC分期、總體生存率有明顯的相關性。本文結論與Lian等［7］和Uchiyama等［10］研究結果一致。

圖2　黑素瘤獨立預后因素相關生存曲線　2A：淋巴結轉移相關生存曲線；2B：5-羥甲基胞嘧啶（5?hmc）表達相關生存曲線；2C：手術切除相關生存曲線；2D：Clark分級相關生存曲線；2E：AJCC分期相關生存曲線

表2　影響黑素瘤生存時間的單因素及多因素分析結果

我們運用單因素Cox回歸模型分析顯示，淋巴結轉移、Clark分級、AJCC分期、5?hmc表達水平與黑素瘤預后相關，多因素分析顯示患者存在遠處淋巴結轉移、未手術切除、5?hmc低水平表達、Clark分級、AJCC分期與黑素瘤預后有關，與本課題組前期分析結果一致［14?15］。本研究中，臨床分期較早并行手術切除的患者預后相對較好，而早期發生淋巴結及遠處轉移的患者臨床分期較晚，不宜行手術切除，輔以放化療及免疫靶向治療，預后相對不佳，提示臨床對黑素瘤早期診斷及行預后評估對延長患者生存率有一定意義。5?hmc在黑素瘤不同臨床分期中表達水平有明顯差異，在有淋巴結轉移、臨床分期較晚、未行手術切除的患者中表達水平降低，臨床分期越晚，其水平越低，提示5?hmc可能作為臨床黑素瘤早期診斷及預后評估的一個新的潛在表觀遺傳學標記物。

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