空氣細顆粒物PM2.5對HaCaT細胞增殖、細胞周期及凋亡的影響

薛晨紅　張宏偉　彭芬　何聰芬　王巧娥　陳周　張建中

100044北京大學人民醫院皮膚科［薛晨紅（現在河南省人民醫院皮膚科，450003鄭州）、彭芬、陳周、張建中］；中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所毒理室（張宏偉）；北京工商大學 北京市植物資源研究開發重點實驗室（何聰芬、王巧娥）

細顆粒物PM2.5是指懸浮于空氣中空氣動力學直徑≤2.5 μm的固態或液態顆粒物。皮膚直接暴露于空氣污染物中，時刻受到污染物的威脅［1］。PM2.5可能通過損害或降解角蛋白，破壞皮膚屏障致病［2］。研究表明，PM2.5不僅與外源性皮膚老化有關，而且與炎癥性皮膚病，如濕疹、特應性皮炎（AD）的發生及嚴重程度相關［3?5］。毒理學研究表明，多環芳烴類為主的有機物、各種重金屬元素（尤其是水溶性金屬）及病原微生物可能是PM2.5起主要毒性作用的成分［6］。但基于PM2.5本身的特性及其吸附成分的復雜性，單一組分的研究并不能完全反映PM2.5對皮膚的整體危害效應。我們收集北京市采暖季霧霾天氣PM2.5，探討PM2.5對HaCaT細胞形態、增殖、周期及凋亡的影響，為PM2.5在皮膚科領域的相關研究奠定基礎。

材料與方法

一、材料

永生化人角質形成細胞HaCaT細胞系來自北京大學人民醫院皮膚科。澳洲胎牛血清及0.25%胰酶（美國Gibco公司），DMEM培養基（美國HyClone公司），CCK8細胞計數試劑盒（日本Dojindo公司），細胞全蛋白提取試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物公司），鼠抗人細胞周期蛋白A2（cyclin A2）單克隆抗體、兔抗人細胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）單克隆抗體（美國Abcam公司），鼠抗人GAPDH多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗鼠、兔二抗（美國Santa Cruz公司），膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（annexin V?FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒（杭州聯科生物公司）。

二、方法

1.PM2.5樣品采集及處理：選擇北京市東二環及東三環交界處，距地面約20 m的建筑物頂部為采樣地點。在12月至次年1月，運用HY?1000智能大流量TSP采樣器（選配PM2.5切割器，青島恒遠科技發展有限公司），使用石英濾膜采樣。平均采樣流量為1 000 L/min，每次連續采樣24 h。采樣后的石英濾膜于恒溫恒濕條件下平衡24 h。將濾膜剪成1 cm×1 cm后浸于75%乙醇中，水浴超聲振蕩60 min以洗脫顆粒物，保持水溫在20℃以下。洗脫液用70 μm濾網過濾到多個培養皿中，紫外燈殺菌，待大部分乙醇溶液揮發掉后再行冷凍干燥處理24 h，最后稱重。用無菌水配制成高濃度儲存液，-20℃保存。以上采集處理均由中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所毒理室完成。

2.實驗分組及濃度設置：HaCaT細胞分為以下幾組，空白組，僅用細胞培養基，無細胞及PM2.5；對照組，不加PM2.5，其他條件同實驗組；實驗組，不同濃度PM2.5處理。細胞形態學觀察與CCK8法檢測細胞增殖實驗中設置50、100、200、400、800 mg/L 5個濃度組。流式細胞儀檢測細胞周期、凋亡及Western印跡法檢測細胞周期相關蛋白實驗中設置100、200、400 mg/L 3個濃度組。

3.細胞培養與混懸液制備：在37℃、5%CO2、濕度飽和的細胞培養箱中用DMEM培養基常規培養HaCaT細胞。取對數生長期細胞，以1×105個細胞/ml的密度接種，貼壁生長至50%～60%融合度時進行下述實驗。用DMEM培養基將PM2.5儲存液稀釋成低濃度工作液。

4.細胞形態學觀察：HaCaT細胞接種于6孔培養板，每孔2 ml。倒置顯微鏡下觀察PM2.5處理24 h后HaCaT細胞形態并拍照記錄。

5.CCK8法檢測細胞增殖：HaCaT細胞接種于96孔培養板，每孔100 μl。含不同濃度PM2.5培養基處理24 h后，吸棄培養基，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1～2次，更換含1%胎牛血清的DMEM培養基每孔100 μl；加入10 μl CCK8檢測試劑，孵育90 min。用酶標儀在雙波長（450 nm、630 nm）模式下測定各孔吸光度（A值）。細胞存活率（%）=（實驗組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）×100%。每組設3個復孔，實驗重復3次。

6.流式細胞儀檢測細胞周期分布：將HaCaT細胞接種于6孔培養板，含不同濃度PM2.5培養基處理24 h后，消化離心收集細胞，4℃PBS洗滌細胞1次，270×g離心5 min，棄上清液；以4℃預冷的2 ml 75%乙醇固定細胞至少1 h，離心棄固定液。配制細胞染色液，加入一定體積染色液（0.6～1.0 ml）重懸細胞沉淀物，避光室溫放置30 min；吹打混勻后用300目濾網過濾至流式管中上機檢測。每組設3個復孔，實驗重復3次。

7.Western印跡法檢測細胞周期相關蛋白表達：PM2.5處理24 h后收集細胞樣品，RIPA裂解液裂解細胞；BCA法測定蛋白濃度；每個加樣孔加入20 μg樣本蛋白進行SDS?PAGE電泳、轉膜、封閉；按合適比例（1∶1 000～1∶4 000）稀釋 cyclin A2、CDK1和GAPDH一抗，4℃搖床孵育過夜；次日洗膜后室溫搖床孵育二抗（1∶5 000稀釋）1 h，洗膜，曝光顯影。使用ImageJ軟件進行灰度值分析。根據目的條帶與GAPDH條帶的灰度比值計算相對灰度值，檢測cyclin A2、CDK1蛋白的表達。實驗重復3次。

8.流式細胞儀檢測細胞凋亡：PM2.5處理24 h后，將細胞培養上清液及用0.25%胰酶消化下來的細胞全部收集于離心管中，360×g離心5 min，棄上清液；4℃預冷的PBS洗滌細胞2次，再次離心棄上清液；1×annexin?V結合緩沖液重懸細胞沉淀物，調整細胞密度為1 × 106個/ml；取100 μl細胞懸液置于流式管中，加入5 μl annexin?V溶液及10 μl PI工作液，室溫避光孵育15 min后再加入400 μl 1×annexin?V結合緩沖液，混勻后立即上流式細胞儀檢測。細胞總凋亡率=早期細胞凋亡率+晚期細胞凋亡率。每組設3個復孔，實驗重復3次。

9.統計學分析：用SPSS16.0軟件進行數據分析，實驗結果以x±s表示，多組間及兩兩組間均值比較分別采用單因素方差分析（One?way ANOVA）及LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1　不同濃度PM2.5對HaCaT細胞形態的影響（×100） 1A：對照組細胞形態均一，呈多角形；1B、1C：細胞形態及數目均無明顯變化；1D：細胞數目有所減少，個別細胞形態不規則；1E：細胞數目明顯減少，部分細胞失去正常形態，漂浮細胞明顯增多；1F：可見大量漂浮細胞，僅少數細胞仍貼壁生長

結　果

一、PM2.5對HaCaT細胞形態的影響

見圖1。對照組及不同濃度PM2.5組（50、100、200、400、800 mg/L）HaCaT細胞處理24 h后，對照組細胞形態均一，分布均勻，貼壁緊密，呈典型鋪路石樣增殖（圖1A）；50、100 mg/L組細胞形態及數目變化均不明顯（圖1B、1C）；200 mg/L組細胞數目較對照組有所減少，個別細胞形態開始變得不規則（圖1D）；400 mg/L組細胞數目明顯減少，部分細胞失去正常形態，漂浮死亡細胞明顯增多（圖1E）；800 mg/L組可見大量漂浮死亡細胞，多數細胞腫脹變形（圖1F）。

二、PM2.5對HaCaT細胞增殖的影響

各組間HaCaT細胞的存活率差異有統計學意義（F=471.25，P＜0.001）。50 mg/L組細胞存活率為（98.49±1.44）%，對照組為（100±4.95）%，兩組差異無統計學意義（P＞0.05）；100、200、400、800 mg/L組細胞存活率分別為（91.77±2.04）%、（80.01±1.57）%、（57.80 ± 1.56）%、（21.98 ± 0.86）%，與對照組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05），且隨著PM2.5濃度升高，細胞存活率明顯降低。

三、PM2.5對HaCaT細胞周期分布的影響

流式細胞儀檢測發現，100～400 mg/L PM2.5處理HaCaT細胞24 h后，隨著PM2.5濃度的升高，G1期細胞比例無明顯變化，S期細胞比例逐漸增高，G2/M期細胞比例逐漸降低，并呈濃度依賴關系（r值分別為0.91、-0.97，均P＜0.05），見表1。

四、PM2.5對細胞周期相關蛋白表達水平的影響

見表1。與對照組相比，100、200、400 mg/L組cyclin A2、CDK1蛋白表達量均降低，200 mg/L組降低最明顯，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

五、PM2.5對HaCaT細胞凋亡的影響

對照組細胞總凋亡率為（6.24±0.17）%，100、200、400 mg/L組分別為（9.98±0.21）%、（12.56±0.74）%、（16.74± 1.48）%，細胞總凋亡率呈濃度依賴性升高（r=0.97，P＜0.05）。見圖3。

表1　不同濃度PM2.5處理HaCaT細胞24 h后細胞周期分布及相關蛋白表達變化（x±s）

圖2　不同濃度PM2.5對HaCaT細胞表達細胞周期蛋白（cyclin）A2及細胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）蛋白的影響　1：對照組；2：100 mg/L PM2.5組；3：200 mg/L PM2.5組；4：400 mg/L PM2.5組。GAPDH：3-磷酸甘油醛脫氫酶

圖3　流式細胞儀檢測不同濃度PM2.5處理HaCaT細胞24 h后細胞凋亡率

討　論

PM2.5化學組分復雜，主要包括無機成分、有機成分、元素碳、微量金屬元素、微生物［7］。既往PM2.5在體外的毒理學研究多集中在呼吸道上皮細胞、肺泡巨噬細胞、血管內皮細胞、外周血淋巴細胞等，但對皮膚細胞的研究不多［8］。本實驗中我們發現，HaCaT細胞在PM2.5處理24 h后，隨著PM2.5濃度升高（0～400 mg/L），細胞數目逐漸減少，漂浮細胞逐漸增多；細胞存活率逐漸下降，細胞增殖明顯受限。這與Li等［9］的研究結果基本一致，說明PM2.5可對HaCaT細胞造成明顯的毒性損傷。

已知細胞增殖與細胞周期密切相關，而細胞周期調控是一個精妙復雜的過程，受cyclin和CDK兩大家族基因的控制。我們用100～400 mg/L PM2.5處理HaCaT細胞24 h后，發現S期細胞比例逐漸升高，G2/M期細胞比例逐漸降低，提示PM2.5導致細胞周期發生紊亂，誘導HaCaT細胞阻滯于DNA合成期，即S期。進一步檢測S期進展相關蛋白cyclin A2、CDK1的表達水平，發現cyclin A2、CDK1的表達水平均有一定程度下降，這種變化趨勢與S期HaCaT細胞比例升高趨勢相一致。進一步研究PM2.5對HaCaT細胞凋亡的影響，發現隨著PM2.5濃度從100 mg/L升高至400 mg/L時，細胞平均凋亡率由9.98%升高至16.74%，說明PM2.5可一定程度促進HaCaT細胞凋亡。丁曉潔［10］在研究PM2.5對人支氣管上皮細胞增殖的影響時發現，PM2.5可通過誘導細胞S期阻滯及一定程度促進細胞凋亡來抑制支氣管上皮細胞增殖。覃輝艷等［11］研究發現，廣州市霧霾天氣PM2.5可誘導人支氣管上皮細胞（16?HBE）凋亡，抑制細胞增殖，導致細胞氧化損傷。角質形成細胞與支氣管上皮細胞同屬上皮來源，研究結果的相似性提示PM2.5可能通過誘導S期阻滯導致HaCaT細胞增殖受限，且S期阻滯可能與cyclin A2、CDK1蛋白的表達下調有關。由于PM2.5的具體成分因采樣時期、地點不同而有所差別，其對機體造成的損傷程度及相關機制也可能不同。本實驗采集的是北京市霧霾天氣PM2.5，其誘導HaCaT細胞產生明顯的細胞毒性，包括引起細胞形態改變、抑制細胞增殖、誘導細胞S期阻滯，一定程度促進細胞凋亡，相關毒性機制尚待進一步研究。

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