健康成人皮膚對(duì)十二烷基硫酸鈉刺激反應(yīng)的反射式共聚焦顯微鏡特征分析

江文才　談益妹　江長(zhǎng)清　徐雅菲　秦鷗

200443上海市皮膚病醫(yī)院皮膚與化妝品研究室

十二烷基硫酸鈉（sodium lauryl sulphate，SLS）是公認(rèn)的皮膚刺激反應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照物，廣泛用于化妝品安全性評(píng)估和職業(yè)性皮膚病刺激成分篩查［1?3］。研究顯示，SLS以不同濃度、刺激時(shí)間以及刺激方式作用于人體后，不同性別和年齡人群會(huì)發(fā)生不同的反應(yīng)［4?6］。但上述研究中不同性別和年齡之間反應(yīng)性強(qiáng)弱的結(jié)論不完全相同，其原因可能與SLS誘發(fā)的皮膚反應(yīng)臨床特征不典型，以及臨床醫(yī)生評(píng)判尺度存在差異有關(guān)。我們用反射式共聚焦顯微鏡（RCM）觀察0.1%和0.5%SLS刺激后，男女性以及18～40歲和41～60歲人群皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞變化及炎癥反應(yīng)情況，分析性別和年齡對(duì)SLS誘導(dǎo)的刺激反應(yīng)的影響；同時(shí)，初步探討RCM在客觀評(píng)價(jià)皮膚反應(yīng)中的應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

124名健康受試者參加本研究。入選標(biāo)準(zhǔn)：受試者無(wú)過(guò)敏史，自愿參加本研究，具有良好的依從性。排除標(biāo)準(zhǔn)：近1個(gè)月內(nèi)使用免疫制劑、抗組胺類(lèi)藥物或非甾體抗炎藥物；哺乳期或妊娠婦女患有炎癥性皮膚病未愈者；試驗(yàn)部位有瘢痕、色素、萎縮、鮮紅斑痣或其他瑕疵而影響試驗(yàn)結(jié)果判定者。本研究通過(guò)上海市皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書(shū)。

二、方法

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將SLS（純度＞99%，英國(guó)Sigma Chemical公司）用蒸餾水分別稀釋為0.1%和0.5%。采用美國(guó)smartPractice公司生產(chǎn)的直徑8 mm圓形Finn Chamber標(biāo)準(zhǔn)芬蘭小室斑試器，加樣量0.02 ml，應(yīng)用3M膠帶固定。采用封閉斑貼試驗(yàn)方法，將0.1%和0.5%SLS及陰性對(duì)照（蒸餾水）同時(shí)貼敷于每位受試者背部肩胛骨下距脊柱中央2.0 cm處，貼敷48 h。分別于去除斑試物0.5、24、48 h進(jìn)行臨床評(píng)估和RCM檢測(cè)。皮膚反應(yīng)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)參照《化妝品皮膚病診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》實(shí)施指南［7］，以“-”和“±”為陰性，“ +～+++”為陽(yáng)性反應(yīng)。RCM檢測(cè)包括采用Block模式拍攝3 mm×3 mm表皮各層和真表皮交界處圖像；采用Stack模式隨機(jī)拍攝4個(gè)位點(diǎn)圖像（最大深度為150.88 μm，每層厚度4.57 μm，共33層），定性分析RCM圖片（0為無(wú)，1為有）。將研究對(duì)象分為18～40歲和41～60歲組，觀察2組以及男女性別間皮膚刺激反應(yīng)和RCM特征。

三、統(tǒng)計(jì)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0。不同組間臨床評(píng)估結(jié)果和RCM特征發(fā)生率比較采用χ2檢驗(yàn)。臨床評(píng)判結(jié)果與RCM參數(shù)之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　果

失訪4人，120人完成全部試驗(yàn)。男61例，年齡（39.02±12.17）歲；女59例，年齡（39.92±12.07）歲，不同性別間年齡分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。18～40歲和41～60歲組各60例，年齡分別為（28.93±5.17）歲和（50.00±6.61）歲，前者男性31例，女性29例，后者男女各30例，不同年齡組間男女性別分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

一、臨床評(píng)估

0.1%和0.5%SLS刺激皮膚后不同時(shí)間，臨床評(píng)估陽(yáng)性反應(yīng)見(jiàn)表1，陰性對(duì)照位點(diǎn)均未出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。去除0.1%和0.5%SLS后24 h，男女性之間及18～40歲和41～60歲組間陽(yáng)性反應(yīng)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

二、RCM特征分析

1.0.1%和0.5%SLS刺激后皮膚RCM特征：見(jiàn)表3、圖1。SLS刺激后常見(jiàn)的RCM特征包括角化不全、角質(zhì)層結(jié)構(gòu)不清、棘層海綿水腫，表皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和真皮乳突毛細(xì)血管擴(kuò)張，偶見(jiàn)表皮微囊腫。去除0.5%SLS后24 h，真皮乳突毛細(xì)血管擴(kuò)張發(fā)生率最高達(dá)95.0%，其次為表皮炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為85.0%。同一時(shí)間點(diǎn)，0.5%SLS組RCM特征陽(yáng)性人數(shù)高于0.1%SLS組。同時(shí)，去除刺激后24 h和48 h，0.5%SLS組角化不全、角質(zhì)層結(jié)構(gòu)不清、海綿水腫、表皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和毛細(xì)血管擴(kuò)張的發(fā)生率均明顯高于0.1%SLS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），并且0.5%SLS組表皮厚度也顯著高于0.1%SLS組（P＜0.05）。去除斑試物后24 h，RCM特征發(fā)生率最高，隨后下降。

表1　0.1%和0.5%十二烷基硫酸鈉（SLS）刺激皮膚后不同時(shí)間陽(yáng)性反應(yīng)情況［例（%）］

表2　十二烷基硫酸鈉（SLS）刺激不同年齡男女受試者皮膚后24 h臨床評(píng)估結(jié)果

表3　去除0.1%和0.5%十二烷基硫酸鈉（SLS）刺激后不同時(shí)間點(diǎn)反射式共聚焦顯微鏡主要特征

2.不同性別人群RCM特征：見(jiàn)表4。0.1%SLS刺激去除24 h時(shí)，女性角化不全、棘層海綿水腫和真皮毛細(xì)血管擴(kuò)張發(fā)生率均高于男性，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；0.5%SLS刺激去除24 h時(shí)，除女性棘層海綿水腫發(fā)生率高于男性（χ2=4.24，P＜0.05）外，其余RCM特征發(fā)生率男女之間均相近。不同濃度SLS刺激后，相同年齡組男女之間表皮厚度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。然而，去除斑試物48 h時(shí)，男性RCM特征轉(zhuǎn)陰率明顯高于女性，其中，0.5%SLS刺激位點(diǎn)男性角化不全、海綿水腫和表皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)陰率分別為24.6%（15/61）、45.9%（28/61）和 49.2%（30/61），而女性分別為10.2%（6/59，χ2=7.79，P＜ 0.01）、33.9%（20/59，χ2=6.51，P＜ 0.05）和32.2%（19/59，χ2=4.75，P＜ 0.05）。

3.不同年齡人群RCM特征分析：由表4可知，0.1%SLS斑貼試驗(yàn)后，18～40歲人群角質(zhì)層結(jié)構(gòu)不清、海綿水腫、表皮炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和毛細(xì)血管擴(kuò)張的發(fā)生率均高于41～60歲，但僅棘層海綿水腫發(fā)生率在兩個(gè)年齡組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.09，P＜0.05）；0.5%SLS刺激后，兩年齡組之間所有RCM特征發(fā)生率比較接近，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同濃度SLS刺激后18～40歲和41～60歲兩個(gè)年齡組人群RCM特征的轉(zhuǎn)陰率基本一致。

4.RCM特征與臨床評(píng)估結(jié)果的相關(guān)性：見(jiàn)表5。0.1%和0.5%SLS刺激去除后24 h，RCM特征與臨床評(píng)估結(jié)果之間均具有良好的相關(guān)性。其中，0.1%SLS刺激后后，棘層海綿水腫和真皮毛細(xì)血管擴(kuò)張的發(fā)生率情況與臨床評(píng)估結(jié)果相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)均為0.77（均P＜ 0.001）；0.5%SLS刺激后，同樣是真皮毛細(xì)血管擴(kuò)張和棘層海綿水腫與臨床評(píng)估結(jié)果的相關(guān)性最高（均P＜0.001）。

相較于兩者之間良好的相關(guān)性，去除斑試物0.5 h后，0.1%和0.5%SLS組表現(xiàn)出2項(xiàng)以上RCM特征的人數(shù)比例分別為17.5%（21/120）和51.7%（62/120），比同一時(shí)刻臨床評(píng)估的陽(yáng)性率［2.5%（3/120）和12.5%（15/120）］更接近去除SLS 24 h后的臨床評(píng)估結(jié)果34.2%（41/120）和85.0%（102/120）。

圖1　0.1%十二烷基硫酸鈉刺激后反射式共聚焦顯微鏡皮膚主要特征　1A：角化不全（黃色箭頭）；1B：角質(zhì)層結(jié)構(gòu)不清（紅色圓圈）；1C：棘層海綿水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（藍(lán)色圓圈代表海綿水腫，紅色箭頭代表炎癥細(xì)胞）；1D：真皮毛細(xì)血管擴(kuò)張；1E：微囊腫（黃色圓圈）。標(biāo)尺=50 μm

表4　去除十二烷基硫酸鈉（SLS）后24 h健康成人皮膚反射式共聚焦顯微鏡特征

表5　去除十二烷基硫酸鈉（SLS）后24 h健康成人皮膚反射式共聚焦顯微鏡特征與臨床評(píng)估結(jié)果的相關(guān)性分析（rs）

討　論

2002年Hicks等［8］首次應(yīng)用RCM觀察到高濃度SLS刺激后，不同膚色人群角化不全、角質(zhì)層結(jié)構(gòu)不清、海綿水腫以及真皮乳突和表皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等RCM特征之間存在差異，并且與組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果高度一致。隨后Astner等［9?10］進(jìn)一步證實(shí)RCM在刺激性接觸性皮炎鑒別診斷中的應(yīng)用價(jià)值。本研究中觀察到的RCM主要特征與上述研究基本一致，但表皮微囊腫發(fā)生率低于上述研究結(jié)果，可能與我們所用的SLS濃度較低有關(guān)。研究同時(shí)顯示，0.5%SLS組臨床評(píng)估結(jié)果和RCM參數(shù)的陽(yáng)性率高于0.1%SLS組，且兩者之間具有良好的相關(guān)性，顯示RCM是一種評(píng)估SLS誘導(dǎo)的皮膚刺激反應(yīng)工具。另外，除去0.1%SLS后0.5 h，僅3例發(fā)生陽(yáng)性皮膚反應(yīng)，而至少1種RCM參數(shù)陽(yáng)性者高達(dá)48例，RCM陽(yáng)性參數(shù)＞2項(xiàng)的受試者中77.8%（14/18）去除斑試物后24 h，臨床評(píng)估轉(zhuǎn)化為陽(yáng)性。同時(shí)伴有角化不全和表皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的24例受試者，均轉(zhuǎn)為紅斑反應(yīng)陽(yáng)性者。由此可見(jiàn)，RCM可用于早期預(yù)測(cè)低濃度化學(xué)物誘發(fā)皮膚刺激反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

SLS斑貼后不同時(shí)間，RCM相關(guān)參數(shù)的主次地位也不斷變化。早期RCM主要特征包括表皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、毛細(xì)血管擴(kuò)張和角化不全；24 h后，真皮毛細(xì)血管擴(kuò)張、表皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和棘層海綿水腫成為主要的陽(yáng)性參數(shù)；48 h時(shí)，棘層海綿水腫和表皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)恢復(fù)最快，而真皮毛細(xì)血管擴(kuò)張和角質(zhì)層結(jié)構(gòu)不清恢復(fù)的速度最慢。

關(guān)于性別對(duì)SLS誘發(fā)皮膚反應(yīng)的影響結(jié)論不盡相同，Robinson［6］和楊麗潔等［11］研究認(rèn)為，男性相對(duì)于女性對(duì)不同濃度刺激物更加敏感。本研究臨床評(píng)估結(jié)果顯示，男女性在0.1%和0.5%SLS刺激后，皮膚陽(yáng)性反應(yīng)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同性別人群中除了0.5%SLS刺激后棘層海綿水腫發(fā)生率女性高于男性外，其他RCM指標(biāo)男女間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可見(jiàn)0.1%和0.5%SLS誘發(fā)的皮膚刺激反應(yīng)無(wú)性別差異，與Meding［12］研究結(jié)果相一致。但在SLS誘導(dǎo)的皮膚反應(yīng)自然轉(zhuǎn)歸過(guò)程中，男性RCM參數(shù)的轉(zhuǎn)陰率均高于女性，提示男性受試者外界化學(xué)物刺激后的皮膚修復(fù)能力強(qiáng)于女性。

有研究顯示，青年人群比老年人群對(duì)外界刺激更容易發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)［6，13］，本研究臨床評(píng)估結(jié)果顯示，0.1%和0.5%SLS刺激后，18～40歲和41～60歲人群之間皮膚刺激反應(yīng)發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，性別和年齡因素對(duì)0.1%和0.5%SLS誘導(dǎo)的皮膚反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展無(wú)明顯影響。RCM在客觀評(píng)估皮膚刺激反應(yīng)中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

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