Notch1信號對銀屑病患者外周血Th17細胞分化和功能的影響

馬蕾　薛海波　高梅蘭　舒春梅　于娟　張俊花

256603山東，濱州醫學院附屬醫院皮膚科（馬蕾、舒春梅、于娟、張俊花），內分泌與代謝病科（薛海波），檢驗科（高梅蘭）

銀屑病是免疫相關的慢性復發性炎癥性皮膚病，其皮損組織中大量的T淋巴細胞及分泌的細胞因子形成異常的免疫微環境，導致表皮角質形成細胞異常分化［1?2］。Th17細胞是以分泌白介素17（IL?17）為特點的CD4+T淋巴細胞亞群，在以銀屑病為代表的皮膚疾病中發揮重要作用［3?5］。Notch信號通路作為一種高度保守的信號轉導通路，在細胞分化、發育過程中尤其是在T淋巴細胞分化中起關鍵作用［6］。有研究表明，在小鼠和人促Th17細胞分化的細胞因子環境中均有Notch1信號分子的活化［7?8］。本研究通過檢測銀屑病患者外周血單個核細胞（PBMC）Notch1信號通路的表達變化以及抑制Notch1信號對銀屑病患者Th17細胞分化和功能的影響，探討Notch1信號通路在銀屑病中的作用及機制。

對象與方法

一、研究對象

2015年9月至2016年10月濱州醫學院附屬醫院門診就診的35例尋常性銀屑病患者，男19例，女16例，年齡18～42（28.7± 6.4）歲，皮損面積與疾病嚴重程度評分（PASI）為 12.6～27.8（20.42±3.83）。入選標準：初診未治或近1個月內未采用系統藥物、光療、生物制劑及外用藥物治療者。健康對照組為32例健康體檢者，男18例，女14例，年齡20～43（32.5±6.7）歲。兩組間性別分布、年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究通過濱州醫學院附屬醫院醫學倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

二、主要試劑及儀器

聚蔗糖、磷酸鹽緩沖液（PBS）、佛波酯、鈣離子載體、布雷菲德菌素A、二甲基亞砜（DMSO）、（2S）-N-N-（3，5-二氟苯乙酰基）-L-丙氨酰-2-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT）（美國Sigma公司），胎牛血清、RPMI 1640培養液（美國Gibco公司），異硫氰酸熒光素（FITC）標記的CD4單克隆抗體、藻紅蛋白（PE）標記的IL?17單克隆抗體、抗CD3單克隆抗體、抗CD28單克隆抗體、重組人白介素1β（IL?1β）、重組人腫瘤壞死因子β（TGF?β）、重組人IL?6、重組人IL?23、抗干擾素γ（IFN?γ）抗體、抗IL?4抗體（美國eBioscience公司），Trizol RNA提取試劑（美國Invitrogen公司），Quantscript RT Kit反轉錄試劑盒、RealMaster Mix試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，IL?17酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國R&D公司），FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司），Rotor?Gene 3000實時PCR儀（澳大利亞Corbett Research公司）。

三、方法

1.標本采集：采集受試對象空腹外周靜脈血10 ml，3 ml用于分離血清，7 ml采用聚蔗糖密度梯度離心法分離獲取PBMC。

2.流式細胞儀檢測Th17細胞占CD4+T淋巴細胞的比例：用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液調整PBMC至2×106/ml，分別加入50 μg/L佛波酯、1 mg/L鈣離子載體和10 mg/L布雷菲德菌素A，37℃、5%CO2條件下共刺激培養5 h；細胞膜FITC?CD4單克隆抗體標記，透膜、固定后PE?（IL?17）單克隆抗體胞內染色；應用FACS Calibur流式細胞儀檢測，每例重復3次，winMDI 2.9軟件分析數據。

3.實時定量反轉錄PCR檢測PBMC中維A酸相關孤兒核受體γt（RORγt）、IL?17、Notch1及發狀分裂相關增強子 1（Hes?1）mRNA 表達水平：采用Trizol RNA提取試劑提取PBMC中總RNA，紫外分光光度儀測定純度，吸光度比值（A260/A280）在1.8～2.0之間為合格標本。反轉錄合成cDNA第1鏈。RORγt、IL?17、Notch1、Hes?1及β肌動蛋白引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。實時PCR定量檢測，每份標本設3個復孔。計算mRNA相對表達量（2?△△Ct），△△Ct=（Ct試驗樣本目的基因-Ct試驗樣本內參基因）-（Ct校準樣本目的基因）-Ct校準樣本內參基因）。

4.ELISA檢測IL?17含量：將倍比稀釋的標準品、血清或經上述刺激的PBMC培養上清液及樣品稀釋液分別加至標準品孔、樣品孔及空白對照孔，每例設3個復孔，按照試劑盒說明書檢測IL?17濃度。

5.γ分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch1信號：將10例銀屑病患者PBMC分別接種于24孔板，每孔 0.5 ml，密度為1× 106/ml；每例患者PBMC隨機分為5組，以DMSO溶解DAPT，RPMI 1640培養液調整DAPT終濃度分別為0（對照組）、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L，DMSO終濃度低于0.1%，對照組為含等量DMSO的RPMI 1640培養液；每組細胞設3個平行孔，37℃、5%CO2條件下培養72 h。

6.CD4+T淋巴細胞的活化與極化：將上述PBMC轉移至被5 g/L抗CD3單克隆抗體及2 g/L可溶性抗CD28單克隆抗體包被的培養板中，加入10 μg/L重組人IL?1β、50 μg/L重組人IL?6、20 μg/L 重組人 IL?23、10 mg/L抗IFN?γ 抗體及10 mg/L抗IL?4抗體，37℃、5%CO2條件下培養72 h。

7.統計學方法：采用SPSS17.0軟件包進行統計學處理，計量資料以x±s表示，外周血中各檢測指標表達水平比較采用獨立樣本t檢驗，各指標之間的相關性檢測采用Pearson相關分析；各濃度DAPT處理組檢測指標表達水平比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1　Notch1、發狀分裂相關增強子1（Hes?1）、維A酸相關孤兒核受體γt（RORγt）、白介素17（IL?17）和β肌動蛋白引物序列

圖1　流式細胞儀檢測健康對照（1A）和銀屑病患者（1B）外周血單個核細胞Th17細胞比例

結　果

一、銀屑病患者PBMC中Th17細胞比例

銀屑病患者PBMC中Th17細胞占CD4+T淋巴細胞比例為2.863%±0.969%，對照組為0.604%±0.124%，兩組比較，t=13.677，P＜ 0.01。見圖1。

二、銀屑病患者外周血RORγt等mRNA表達水平及血清IL?17含量

銀屑病患者 PBMC 中 RORγt、IL?17、Notch1、Hes?1 mRNA表達水平及血清中IL?17含量均高于對照組（P＜0.01）。見表2。

三、銀屑病患者PBMC中Notch1 mRNA表達水平與PASI等指標的相關性

銀屑病患者外周血Notch1 mRNA表達水平與PASI（r=0.584）、Th17細胞比例（r=0.544）、RORγt mRNA表達水平（r=0.518）、IL?17 mRNA表達水平（r=0.549）及血清IL?17含量（r=0.511）均呈正相關（P＜ 0.05）。

四、DAPT阻斷Notch1信號對銀屑病患者PBMC中Th17細胞比例等指標的影響

不同濃度DAPT組Th17細胞比例、RORγt mRNA表達水平、IL?17 mRNA表達水平及培養上清液IL?17含量差異均有統計學意義（P＜0.01），2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L DAPT組各檢測指標均低于對照組（P＜0.05），且隨DAPT濃度增加，Th17細胞比例、RORγt及IL?17表達水平呈降低趨勢。見表3。

表2　銀屑病患者外周血單個核細胞中維A酸相關孤兒核受體γt（RORγt）、白介素17（IL?17）、Notch1、發狀分裂相關增強子l（Hes?1）mRNA表達水平（2?△△Ct）及血清中IL?17含量（x±s）

表3　不同濃度γ分泌酶抑制劑DAPT處理組銀屑病患者外周血單一核細胞Th17細胞比例和維A酸相關孤兒核受體γt（RORγt）、白介素17（IL?17）mRNA表達水平（2?△△Ct）及培養上清液IL?17含量（x± s）

討　論

本研究結果顯示，Th17細胞及其特異性轉錄因子RORγt、效應性細胞因子IL?17在銀屑病患者外周血中均呈高水平表達，說明Th17細胞在銀屑病病程中發揮重要作用。

有研究表明，Notch1信號分子在銀屑病皮損組織中高表達，并參與角質形成細胞的分化調控［2，9?12］。本研究結果顯示，Notch1信號分子及其靶基因Hes?1在銀屑病患者外周血中明顯高表達，且與Th17細胞比例、RORγt及IL?17表達水平呈正相關，表明Notch1信號分子參與銀屑病發生發展過程。阻斷Notch1信號通路可明顯下調Th17細胞相關細胞因子產生，減輕Th17細胞及其效應細胞因子IL?17介導的實驗性自身免疫腦脊髓膜炎的疾病進程，利用siRNA特異性阻斷Notch1信號分子表達同樣能夠抑制IL?17在極化的人Th17細胞中的表達和分泌［7?8］。Notch1信號通路亦能調控Th17細胞特異性轉錄因子RORγt［13］，特異性阻斷Notch1信號分子能導致RORγt的表達水平降低［7］。本研究結果顯示，Notch1信號阻斷劑DAPT能降低銀屑病患者PBMC中Th17細胞比例及其特異性RORγt、IL?17的表達與分泌，且隨DAPT濃度增加上述指標呈降低趨勢。我們前期研究發現，DAPT能夠劑量依賴性降低銀屑病小鼠模型脾臟Th17細胞比例及RORγt、IL?17的表達［14］。以上研究結果表明，在銀屑病疾病過程中，Notch1信號分子發揮對Th17細胞分化和功能的調控作用。進一步開展Notch1信號干擾或過表達對銀屑病Th17細胞分化和功能影響的研究，將更加明確該信號通路對銀屑病Th17細胞的調控機制。

綜上，銀屑病患者高表達的Notch1信號分子可能通過促進Th17細胞分化及IL?17表達與分泌，增加Th17細胞的致炎作用，促發和加重銀屑病皮損的炎癥反應，Notch1信號分子可能成為銀屑病治療的一個新靶點。

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