定量檢測綠色熒光蛋白-輕鏈蛋白3轉基因小鼠角質形成細胞自噬水平

金婷婷　Heidemarie Rossiter　Michael Mildner　Florian Gruber Leopold EckhartErwin Tschachler　趙邑

100034北京大學第一醫院皮膚性病科［金婷婷（現在浙江省人民醫院整形外科，310000 杭州）］；奧地利維也納醫科大學（Heidemarie Rossiter、Michael Mildner、Florian Gruber、LeopoldEckhart、ErwinTschachler）；清華大學附屬北京清華長庚醫院皮膚科（趙邑）

自噬是對細胞內物質進行自我消化的動態過程，對于機體生長發育、生理變化和疾病發生具有重要作用［1?2］。自噬發生時，微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）由胞質可溶性Ⅰ型LC3（LC3?Ⅰ）與磷脂酰乙醇胺共價結合變為Ⅱ型LC3（LC3?Ⅱ）聚集到自噬體膜上，其含量與自噬小體數量成正比。因此通常把LC3作為自噬標記蛋白用于自噬研究［3］。我們對綠色熒光蛋白-輕鏈蛋白3（GFP?LC3）轉基因小鼠的角質形成細胞分別給予饑餓處理和UVA照射，觀察到GFP?LC3綠色熒光由胞質彌漫分布變為聚集的熒光斑點（指示自噬小體）。在此基礎上，利用ImageJ軟件宏程序嘗試對GFP?LC3熒光標記的自噬小體進行自動、快速定量，以探索一種更為簡捷、客觀、準確的高通量定量檢測自噬水平的方法。

材料與方法

1.試劑和儀器：角質形成細胞培養基、基礎培養基（美國Lonza公司），胃酶抑素A（美國Selleck公司），4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司），Hoechst 33258（美國Millipore公司），甘油封片劑（北京萊恩多美科技有限公司），Sellamed 3000 UVA?1燈（德國Sellas公司），紫外線指數檢測儀（德國Waldmann公司），LSM700激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）。

2.細胞培養：按文獻［4］培育GFP?LC3轉基因小鼠并原代培養鼠尾角質形成細胞。GFP?LC3轉基因小鼠角質形成細胞（第9代）在培養基中重懸后接種于1 cm×1 cm蓋玻片上，置于37℃含5%CO2培養箱中，當細胞80%融合時開始處理細胞。

3.自噬誘導：將培養的GFP?LC3小鼠角質形成細胞隨機分為對照組、饑餓組、20 J/cm2UVA和40 J/cm2UVA照射組。照射組UVA光源高度30 cm，功率66 mW/cm2。照射前吸去原培養基，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗2次后加入1 ml PBS。照射完成后，吸去PBS，加入2 ml培養基并置于37℃含5%CO2培養箱中繼續培養6 h。饑餓組給予饑餓處理，即將完全培養基吸去，用PBS漂洗2次后，加入2 ml基礎培養基培養6 h。對照組給予和照射組基本相同的處理，僅在照射時給予錫箔紙遮蓋避光。為了檢測自噬流，自噬誘導處理前在部分細胞培養基中加入胃酶抑素A（10 μg/L），培養12 h后按分組給予上述不同處理。各組細胞培養6 h后，用4%多聚甲醛固定15 min后，加入Hoechst 33258室溫放置15 min染色細胞核。實驗重復3次。

4.激光共聚焦顯微鏡觀察及圖像采集：將固定后的細胞爬片輕輕覆蓋于滴加了封片劑的載玻片上，用濾紙吸去多余封片劑。置于LSM700激光共聚焦顯微鏡下，選擇488 nm波長激光和紫外線分別激發GFP和Hoechst 33258，40倍物鏡觀察并拍照。每組細胞拍攝多個視野，每個視野自細胞底部、中部至頂部拍攝4～5張圖片（Z?stack），選擇中部熒光最亮的圖片進行定量分析。

5.ImageJ軟件自動檢測自噬點數量：用ImageJ軟件計數細胞自噬點。自行編程設定一個宏指令“GFP?LC3”，用于計算綠色熒光點的數量與大小。簡要步驟為：打開前述步驟中獲取的待分析圖片，拆分色彩通道（“Split Channels”）為綠色（green）、紅色（red）和藍色（blue），選綠色通道，反轉顏色（“Invert”），見圖1；設置顏色閾值為0 ～ 160，然后分析顆粒（“Analyze Particles”，設定顆粒大小4 ～ 40），即可得到熒光點數量和大小數據。程序可自動逐次打開文件夾內每張圖片，進行分析后關閉圖片。所有分析結果自動存儲到結果表格中。分析細胞總數量時，把圖片設置為32?bit型，翻轉顏色（“Invert”），設置顏色閾值為0 ～ 110，然后分析顆粒（“Analyze Particles”，設定顆粒大小1000?Infinity）。結果數據獲取及存儲同前。

6.統計學分析：結果以x±s顯示。采用SPSS 23.0對數據進行統計學分析。各實驗組間自噬熒光點的比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA），兩兩比較采用LSD法。統計學檢驗均采用雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結　果

應用ImageJ軟件宏指令可以成功識別熒光圖片中自噬熒光點。用測試計算機［英特爾Core（TM）i3?5010U CPU，2.1G Hz，4 GB內存，Windows 1 064位操作系統］分析68張420萬像素的圖片，耗時僅約40 s，分析每張圖片平均僅需0.59 s。

未加入胃酶抑素A時，饑餓組、20 J/cm2和40 J/cm2UVA照射組每個細胞內平均自噬熒光點數量高于對照組；而UVA照射組與饑餓組間、不同劑量UVA組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。自噬誘導前在培養基中加入胃酶抑素A處理12 h，饑餓組、20 J/cm2和40 J/cm2UVA照射組每個細胞內平均自噬熒光點數量顯著高于對照組；而UVA照射組與饑餓組間、不同劑量UVA組間自噬水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

圖1　利用ImageJ軟件檢測細胞及自噬小體數量　1A：激光共聚焦顯微鏡采集原始圖片（×400）；1B：經過ImageJ軟件反轉圖片

表1　ImageJ軟件自動檢測綠色熒光蛋白-輕鏈蛋白3轉基因小鼠角質形成細胞各實驗組自噬水平（x±s）

討　論

盡管自噬檢測技術不斷更新，但如何準確鑒別、觀察、定量細胞自噬始終是自噬領域研究的關鍵。目前常用的自噬檢測方法主要有電鏡下觀察雙層膜的自噬體結構，Western印跡檢測LC3B?Ⅱ蛋白的表達水平以及熒光顯微鏡檢測GFP?LC3等融合蛋白的熒光改變［5］。電鏡檢測自噬相關組分仍是金標準，除了能夠觀察超微結構，還可用于定量分析［6］。在超微結構水平上，觀察到雙層膜結構的自噬小體，在電鏡檢測中對胞質面積和自噬小體或自噬溶酶體面積進行定量，計算自噬小體或自噬溶酶體占胞質面積的比例并進行定量分析，從而評價細胞自噬流的活化情況［7］。然而這種檢測方法具有以下缺點：①從準備標本開始到最后觀察，耗時較長，成本較高［8?9］；②標本制備對檢測結果至關重要，要盡可能保持樣本的天然特征及其在檢測環境中的穩定性，避免人為因素干擾，對研究者的操作技術提出較高要求；③由于樣本的復雜性和多樣性，準確區分自噬小體和自噬溶酶體并不容易，容易把很多亞細胞結構錯當成自噬組分［9］。因此，電鏡多用于自噬的定性研究，用它來定量自噬尚存在較大爭議。Western印跡檢測LC3?Ⅱ/LC3?Ⅰ比值或LC3?Ⅱ/內參蛋白比值［10］除了能判斷自噬是否發生外，還可以測定條帶灰度實現半定量。但是，該方法的最大缺陷在于無法直觀觀察自噬流的動態改變。

近年最常用的自噬研究方法是觀察熒光標記的LC3?Ⅱ在自噬小體膜上聚集的情況，即通過構建GFP?LC3質粒、腺病毒轉染細胞或者培育GFP?LC3轉基因小鼠觀察自噬發生后細胞GFP?LC3熒光點的變化。目前有兩種量化GFP?LC3熒光點的方法，一是計數一定數量細胞中GFP?LC3熒光點超過設定參考值的細胞比例，二是通過計數一定數量細胞的GFP?LC3熒光點總數，定量每個細胞的平均熒光值［5］。這種定量方法與電鏡相比，操作更為簡單，并且可以在不同時間點進行動態觀察、計數。在熒光顯微鏡下檢測自噬小體可以采用人工計數或者計算機軟件定量的方法，而前者存在以下缺陷：①耗時太長［3］；②肉眼分辨能力有限，無法識別一些小的自噬小體［11］；③主觀偏差較大，有待建立統一的標準［3，5］。因此，我們通過編輯ImageJ軟件來評價自噬水平，一次可對大量圖片數據進行自動分析，并且更為客觀準確。

本研究采用UVA照射GFP?LC3轉基因小鼠的角質形成細胞誘導自噬，以饑餓作為陽性對照，可以觀察到UVA能誘導GFP?LC3綠色熒光點數量上升。單純的GFP?LC3熒光點聚集既可能是自噬信號活化的體現，也可能是自噬降解受阻導致，因此我們使用溶酶體酶抑制劑胃酶抑素A作為對照。在經過胃酶抑素A處理之后，各實驗組分別給予相同處理，結果仍顯示UVA照射組自噬水平高于對照組。這表明UVA照射能誘導角質形成細胞產生自噬，與之前研究的結論一致［4，12］。以上結果證明，采用ImageJ軟件定量細胞的自噬小體數量，能準確反映細胞整體的自噬水平。此外，我們也觀察到在20 J/cm2和40 J/cm2兩種劑量組間細胞自噬水平無明顯差異，可能一方面是當前兩種劑量下自噬水平差異不顯著，另一方面是該方法不足以檢測出當前劑量組之間的自噬水平差異。因此，還需要設立更多不同劑量UVA照射組進行驗證。

如前所述，這種方法的優點是能快速自動計算各實驗組單個細胞自噬點的相對數量，體現在以下3個方面：①通過計數一定區域內細胞個數和GFP?LC3熒光點總數，得到不同組每個細胞自噬點的平均數量，輔以對照組設計，可以進行較精確的定量分析研究；②能同時分析多張圖片，實現高通量檢測細胞自噬水平；③通過設定軟件，可以完全實現自動計數，快速獲取結果。這種依賴圖像進行分析的方法對采集圖片的條件要求高，所有圖片需在統一環境、時間、參數下采集，以獲得統一質量的圖像；其次對圖片的質量要求高，需在高倍鏡下拍攝高分辨率的圖片，有文獻認為拍攝倍數應高于40［13］。因而它的局限性在于圖片拍攝條件和拍攝質量的一致性對分析結果影響較大。細胞內非特異性熒光點造成的假陽性可導致高估細胞自噬水平，但通過用盡可能高的拍攝倍數可減少這種因素引起的假陽性。另一方面細胞核底部自噬點被遮擋等原因可造成對自噬水平的低估，應用該方法時應通過多次重復及合理設立對照以消除此類系統誤差。此外，本研究還有一些局限性，如未用金標準方法檢測細胞自噬，也沒有用Western印跡檢測LC3水平進行對照，主要原因是Western印跡的半定量特征無法滿足定量檢測要求。

綜上，我們利用自行設定的ImageJ軟件宏指令程序，可對大量的圖片數據進行自動評估和自噬熒光點定量，從而較為精確地檢測細胞自噬水平，為自噬的定性定量研究提供一種簡單快速的高通量成像分析方法。

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