泛素連接酶Cbl?b基因短發(fā)卡RNA慢病毒載體構(gòu)建及其對A375細胞生物學行為的影響

王小坡　倪娜娜　熊競舒　宋昊　姜祎群　陳浩　曾學思　孫建方210042南京，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病研究所病理科

Casitas B?lineage lymphoma（Cbl）?b是泛素連接酶Cbl家族成員之一，Cbl?b干擾能增強獲得性（T細胞）和先天性（自然殺傷細胞）抗腫瘤免疫效應［1?2］。Ito等［3］研究發(fā)現(xiàn)，Cbl?b在胃癌組織中高表達，且與胃癌侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Nam等［4］研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞系MDA?MB?231中應用siRNA抑制Cbl?b表達或敲除Cbl?b基因后，MDA?MB?231細胞喪失降解基質(zhì)的活性，其浸潤活性受到顯著抑制。Qu等［5?6］研究發(fā)現(xiàn)，紫草素誘導肺癌細胞凋亡與Cbl?b蛋白抑制ERK信號通路和負性調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路有關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，黑素瘤組織及細胞株均高表達Cbl?b蛋白，并且Cbl?b表達水平與黑素瘤進展、Clark分級和Breslow厚度均呈正相關(guān)，推測Cbl?b可能作為癌基因參與黑素瘤發(fā)病過程［7］。為進一步驗證該設想，我們構(gòu)建Cbl?b shRNA慢病毒載體，探討其對黑素瘤A375細胞增殖、凋亡、細胞周期及侵襲等生物學行為的影響。

材料與方法

一、主要試劑與細胞

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（美國Gibco公司），DNA限制性內(nèi)切酶（AgeI、EcoRI）、T4 DNA連接酶（立陶宛MBI Fermentas公司），RNAi?Mate轉(zhuǎn)染試劑、慢病毒載體pGLVU6/Puro和包裝質(zhì)粒（上海吉瑪公司），DNA凝膠回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司），質(zhì)粒中量抽提試劑盒（杭州愛思進生物技術(shù)有限公司），Cbl?b鼠單克隆抗體（sc?8006）（美國Santa Cruz公司），Transwell小室（美國Corning公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司），實時熒光定量PCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司），細胞計數(shù)試劑盒8（CCK8，日本同仁公司），凝聚胺（美國Sigma公司），異硫氰酸熒光素-膜聯(lián)蛋白V/碘化丙錠（Annexin V?FITC/PI）凋亡檢測試劑盒（美國ADL公司）。

大腸桿菌感受態(tài)細胞JM 109（上海吉瑪公司），A375細胞系（中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所中心實驗室保存），293T細胞株（中國科學院細胞庫）。

二、試驗方法

1.Cbl?b shRNA慢病毒載體設計和構(gòu)建：從GenBank中獲取人Cbl?b mRNA的完整序列（NM_001321786.1），利用Designer3.0軟件設計3條靶向Cbl?b基因的shRNA 序列即 CBLB?shRNA?1（5′?GCCTGGATCTAATTCAGAAAG?3′）、CBLB?shRNA?2（5′?GCAAGTGGCCAAGTTCCTTTG ?3′）、CBLB ?shRNA?3（5′?GGAACACATGGTCCATCTTCA?3′）及1條陰性對照（5′?TTCTCCGAACGTGTCACGT?3′）序列，Blast分析表明以上4條序列均不與人其他任何cDNA序列同源。根據(jù)以上4段序列分別設計合成4對寡核苷酸序列，每對包含1條正義鏈和1條反義鏈。引物由上海吉瑪公司合成，退火后配對形成雙鏈DNA。通過T4 DNA連接酶，將雙酶切線性化后的慢病毒載體pGLVU6/Puro和雙鏈DNA片段進行連接反應。用連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞JM 109，挑取轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR鑒定、測序，質(zhì)粒抽提試劑盒抽提去內(nèi)毒素的質(zhì)粒，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.慢病毒包裝：轉(zhuǎn)染前24 h接種293T細胞，待細胞達到70%～80%融合時，將重組慢病毒質(zhì)粒載體 pGLVU6/Puro?shRNA 和包裝質(zhì)粒（pGag/Pol、pRev、pVSV?G）的DNA混合液與轉(zhuǎn)染試劑RNAi?Mate混合，共轉(zhuǎn)染293T細胞。培養(yǎng)72 h后，收集293T細胞上清液，用孔徑0.45 μm過濾器過濾，病毒上清液通過超離心濃縮、收集分裝，-80℃保存。

3.慢病毒轉(zhuǎn)染A375細胞：將A375細胞按1×104/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別以1×107滴度的 CBLB?shRNA?1、CBLB?shRNA?2、CBLB?shRNA?3及陰性對照病毒轉(zhuǎn)染，加入終濃度為5 mg/L聚凝胺。同時設立轉(zhuǎn)染空載體的空白對照組，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)72 h收樣。

4.實時熒光定量PCR檢測Cbl?b mRNA水平：轉(zhuǎn)染后72 h用Trizol提取A375細胞總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，實時熒光定量PCR檢測Cbl?b mRNA表達水平。Cbl?b正向引物5′?GATG AATCGGTTGGCAAAC?3′，反向引物：5′?GGGTGGC AGGCTTAGATG ?3′，目的產(chǎn)物 139 bp。內(nèi)參照3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）正向引物 5′?AAATCCCATCACCATCTTCC?3′，反向引物：5′?ATGACCCTTTTGGCTCCC?3′，目的產(chǎn)物 147 bp。PCR擴增條件：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火/延伸30 s，收集每個循環(huán)熒光，共40個循環(huán)。所有試驗重復3次。以2?△△Ct值表示Cbl?b mRNA相對表達量。

5.Western印跡檢測Cbl?b蛋白水平：轉(zhuǎn)染后72 h提取A375細胞總蛋白，變性后取等量蛋白50 μg上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS?PAGE）電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，分別加入鼠Cbl?b單克隆抗體（1∶500）及鼠GAPDH抗體（1∶1 000），4℃搖床振蕩孵育過夜。PBS漂洗濾膜4次，每次10 min。將聚偏氟乙烯膜與辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗（1∶5 000）室溫振蕩孵育2 h。顯影，曝光，成像。用Image J分析軟件分析條帶灰度，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

6.CCK8法檢測細胞增殖：將轉(zhuǎn)染后72 h的A375細胞以3 × 103個/孔接種于96孔板，每孔100 μl，每組設5個復孔，同時設空白對照組（僅加培養(yǎng)基），分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，傾去培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基 100 μl，避光加入 CCK8 試劑 10 μl，避光37℃繼續(xù)培養(yǎng)3 h，以正常對照孔調(diào)零，酶標儀450 nm處測各孔吸光度（A值）。

7.流式細胞儀檢測細胞凋亡：轉(zhuǎn)染后72 h收集A375細胞，在細胞懸浮液中加入5 μl Annexin V?FITC/PI，輕輕混勻后于2～8℃避光孵育15 min，加入10 μl PI，2～ 8℃避光孵育5 min。1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測?？偟蛲雎?早期凋亡率+晚期凋亡率。

8.流式細胞儀檢測細胞周期：轉(zhuǎn)染后72 h，胰酶消化細胞，離心沉淀，1 ml預冷的PBS混懸細胞，離心沉淀，加入2 ml預冷75%乙醇，4℃固定24 h，再次離心沉淀，每管加入100 μl PI，4℃避光30 min后，流式細胞儀檢測。

9.Transwell檢測細胞侵襲能力：采用24孔Transwell系統(tǒng)。小室內(nèi)加入60 μl基質(zhì)膠（Matrigel，1∶6稀釋），將轉(zhuǎn)染后72 h的A375細胞按1× 103個/孔接種于Transwell小室，下室加入血清濃度為20%的培養(yǎng)液700 μl，37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。擦去小室表面的Matrigel膠，固定，結(jié)晶紫染色。顯微鏡下觀察計數(shù)，每孔隨機選取5個視野，取平均值，每組重復3次。

10.統(tǒng)計學方法：采用SPSS 23.0軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示。多組間均數(shù)比較采用方差分析，各組隨時間變化的趨勢采用重復測量因素方差分析，多重比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　果

一、慢病毒載體的測序鑒定

測序結(jié)果證實，3個重組克隆中插入片段序列與所設計的寡核苷酸序列完全一致，慢病毒載體構(gòu)建成功。

二、Cbl?b mRNA干擾效率

慢病毒轉(zhuǎn)染后72 h，CBLB?shRNA?1組、CBLB?shRNA?2組、CBLB?shRNA?3組、陰性對照組、空白對照組的Cbl?b mRNA相對表達量分別為0.63±0.05、1.02±0.04、1.04±0.04、0.98±0.04和1.00±0.00（F=67.866，P＜ 0.05）。CBLB?shRNA?1組與其余各組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而其余各組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。CBLB?shRNA?1組干擾效率最好，與空白對照組相比沉默效率為37%。

三、Cbl?b蛋白沉默效果

慢病毒轉(zhuǎn)染后72 h，CBLB?shRNA?1組、CBLB?shRNA?2組、CBLB?shRNA?3組、陰性對照組、空白對照組的蛋白相對表達量分別為1.24、0.13、0.00、1.17、1.00（圖 1），可見CBLB?shRNA?2組、CBLB?shRNA?3組均有一定沉默效果，與空白對照組相比沉默效率分別為87%、100%，選擇蛋白沉默效率最高的CBLB?shRNA?3進行后續(xù)試驗。

四、干擾Cbl?b表達對A375細胞增殖的影響

見圖2。陰性對照組、空白對照組和CBLB?shRNA?3組間細胞增殖能力差異有統(tǒng)計學意義（F組別=12.847，P＜0.01），各組增殖能力隨時間延長而增加（F時間=948.73，P＜0.01），組別與時間之間無交互作用（F交互=2.365，P＞0.05）。24、48 h時3組間增殖能力差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而72、96 h時CBLB?shRNA?3組增殖能力均明顯低于陰性對照組和空白對照組（P＜0.01）。

圖1　慢病毒轉(zhuǎn)染A375細胞72 h后Cbl?b蛋白表達　1：CBLB?shRNA?1組；2：CBLB?shRNA?2組；3：CBLB?shRNA?3組；4：陰性對照組；5：空白對照組

圖2　Cbl?b干擾對A375細胞增殖的影響　72、96 h時CBLB?shRNA?3組增殖活性顯著低于另2組，P＜0.01

圖3　干擾Cbl?b表達對黑素瘤A375細胞凋亡的影響　左上象限為死亡細胞，右上象限為晚期凋亡細胞，右下象限為早期凋亡細胞，左下象限為正?；盍毎?。CBLB?shRNA?3組凋亡率顯著高于陰性對照組和空白對照組

表1　Cbl?b干擾對A375細胞周期分布的影響（%，x±s）

五、干擾Cbl?b表達對A375細胞凋亡、細胞周期、細胞侵襲能力的影響

陰性對照、空白對照組和CBLB?shRNA?3組細胞凋亡率分別為（6.08±1.35）%、（6.34±1.07）%、（22.73±6.58）%，差異有統(tǒng)計學意義（F=17.693，P＜ 0.01）。CBLB?shRNA?3組凋亡率明顯高于陰性對照組和空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3。

陰性對照、空白對照組和CBLB?shRNA?3組G1期、S期細胞比例差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而G2期細胞比例差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。CBLB?shRNA?3組G1期細胞比例高于陰性對照組和空白對照組，而S期細胞比例低于陰性對照組和空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

陰性對照、空白對照組和CBLB?shRNA?3組穿膜細胞數(shù)分別為76.60±1.82、73.20±3.83、19.60±1.14，差異有統(tǒng)計學意義（F=794.50，P＜ 0.01）。CBLB?shRNA?3組穿膜細胞數(shù)顯著低于陰性對照和空白對照組（P＜0.01）。

討　論

近年發(fā)現(xiàn)，若干基因突變和異常的細胞信號通路參與惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展，這些發(fā)現(xiàn)促進了靶向治療藥物和免疫治療藥物的發(fā)展［8］。

RNA干擾（RNAi）技術(shù)是指由小片段雙鏈RNA分子介導的生物細胞內(nèi)同源基因的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。慢病毒介導的RNAi具有轉(zhuǎn)染效率高、可感染分裂細胞和非分裂細胞、目的基因可在宿主細胞中長時間穩(wěn)定表達以及安全性好等諸多優(yōu)點［9］。本研究中，我們設計、合成3條針對Cbl?b基因的shRNA靶點序列，進行shRNA重組慢病毒表達載體的包裝，轉(zhuǎn)染人黑素瘤A375細胞，篩選干擾效果最明顯的靶序列。Western印跡顯示，CBLB?shRNA?3蛋白沉默效率最高，但對Cbl?b mRNA水平無明顯影響，其原因可能是miRNA可以表現(xiàn)出siRNA樣作用，而siRNA也可顯示出miRNA樣作用。有學者認為siRNA表現(xiàn)出miRNA作用是因為siRNA與mRNA堿基未能完全互補，但把這種現(xiàn)象歸因于siRNA和靶mRNA之間的堿基互補程度是不確切的［10?11］。在siRNA被組裝成RNA誘導沉默復合體過程中，若RISC復合體中Ago蛋白具有RNA催化活性（人類4種Ago中僅Ago2具有此活性），可引起靶mRNA降解。有時RISC中的Ago不具有降解靶mRNA催化活性而起到抑制翻譯作用［12］。我們設計的CBLB?shRNA?3可能在細胞內(nèi)招募了不具有RNA催化活性的Ago家族蛋白，產(chǎn)生了miRNA樣作用，即高度互補的shRNA干擾序列靶向mRNA，未產(chǎn)生降解，但抑制mRNA翻譯，具體機制尚需要進一步研究。因為生物功能行使是通過蛋白來實現(xiàn)的，所以我們選擇蛋白沉默效率最高的CBLB?shRNA?3進行后續(xù)試驗。

本研究中我們采用CCK8試驗在體外證實Cbl?b干擾能夠抑制黑素瘤A375細胞的增殖。同時，還證實Cbl?b干擾能夠使黑素瘤A375細胞周期發(fā)生G1期阻滯，并促進細胞凋亡。因此，我們推測Cbl?b一方面促進細胞周期轉(zhuǎn)化，加速細胞分裂，產(chǎn)生更多細胞；另一方面通過抑制細胞凋亡，延長細胞存活時間參與黑素瘤的發(fā)生發(fā)展。在細胞侵襲試驗中，Cbl?b干擾能使A375細胞進入Transwell小室下層的數(shù)目明顯小于空白對照組及陰性對照組，說明Cbl?b具有促進黑素瘤細胞侵襲的生物學功能。本研究我們僅探討了沉默黑素瘤A375細胞Cbl?b對細胞增殖、細胞周期、細胞侵襲能力等體外腫瘤生物學行為的影響，下一步可利用裸鼠皮下成瘤實驗，觀察沉默Cbl?b在體內(nèi)對黑素瘤生物學行為的影響，并利用蛋白質(zhì)組學探討Cbl?b參與黑素瘤發(fā)病的可能分子通路機制。

綜上所述，Cbl?b可能參與黑素瘤的發(fā)生發(fā)展過程，深入了解Cbl?b的促癌機制可能為黑素瘤的治療提供新思路，針對Cbl?b的靶向治療有望成為黑素瘤治療的新靶點。

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