大鼠腦創傷模型中Leptin蛋白表達的時間依從性變化

張　婷　宋　宇　魏志玄

1)南陽醫學高等專科學校基礎醫學部病理教研室，河南 南陽 473061　2)南陽醫學高等專科學校第三附屬醫院神經外科，河南 南陽 473000　3)南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院神經外科，河南 南陽 473000

創傷性腦損傷能夠造成IL-6、IL-1β、TNF-α等因子的持續產生和釋放，使這些炎癥因子在細胞外和腦脊液中的濃度增加。這些細胞因子是中樞神經系統免疫反應的重要調節因素，在神經保護和神經損傷方面均起重要作用。Leptin蛋白通過OB基因編碼16 KD的非糖基化蛋白分子，是由167個氨基酸組成的短肽，由脂肪組織產生并分泌進入循環系統，與下丘腦發生聯系，能夠調節能量的儲存和飽脹感，從而影響體質量、代謝率和體溫，Leptin蛋白在下丘腦-垂體-脂肪軸中起重要的作用。最近的研究表明[1-5]，Leptin蛋白可能參與應激反應，促炎癥細胞因子能夠誘導其表達。本文研究Leptin蛋白在創傷性腦損傷大鼠模型腦組織中的時間依從性變化，并探討其與炎癥細胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)之間的關系。

1　材料和方法

1.1實驗動物及分組健康成年雄性SD大鼠33只(湖北省實驗動物中心提供)，體質量250～300 g，應用隨機數字表將大鼠進行完全隨機化分組，分為對照組(假手術組)3只，中型腦損傷組15只，重型腦損傷組15只。

1.2大鼠腦挫裂傷模型制作方法以氯胺酮按照60 mg/kg腹腔內注射麻醉大鼠后，大鼠腦立體定位儀固定大鼠頭部，剪去頂部皮毛，消毒皮膚后，正中切開頂部頭皮，剝離骨膜顯露左頂骨，于中線左側旁開約3 mm，前囪后約2 mm處用開一直徑5 mm圓形骨窗，保持硬膜完整。采用自由落體打擊裝置，以40 g砝碼于20 cm高處通過金屬導桿落下，撞擊置于硬腦膜上的圓錐上致腦挫裂傷，通過調節圓錐尖端的長度調節腦挫傷的程度(中型1.5 mm，重型2.7 mm)，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。

1.3標本制備分別于模型制作成功后第1、3、5天迅速斷頭處死小鼠，制備腦組織勻漿，取挫傷的大腦組織(去除小腦和延髓部分)，稱重后移入玻璃勻漿管中，加入9倍體積的預冷生理鹽水，4 ℃條件下充分研碎勻漿，制備10%勻漿，離心機4 000 rpm離心10 min，取上清液，-80 ℃凍儲存。

1.4檢測方法所有標本細胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)及Leptin蛋白均采用酶聯免疫吸附劑測定分析方法ELISA的方法進行檢測，用抗大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α、Leptin單抗分別包被于酶標板上，標準品和樣品中的IL-6、IL-1β、TNF-α、Leptin與單抗結合，加入生物素化的抗人IL-6、IL-1β、TNF-α、Leptin形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液，在450 nm處測OD值，IL-6、IL-1β、TNF-α、Leptin濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中IL-6、IL-1β、TNF-α、Leptin濃度。

1.5統計學分析運用SPSS 17.0軟件進行數據分析，計量資料進行數據的分布描述，計量資料的比較采用Mann-Whitney檢驗，2組或3組之間的數值比較采用Kruskal-Wallis檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2　結果

在模型制作過程中，2只大鼠死亡并被替換，中型腦損傷組，腦損傷后第1天，腦組織中的IL-6、IL-1β、TNF-α和Leptin的濃度與對照組相比顯著增高(P<0.05)，第3天，第5天回歸至對照組水平，IL-6、IL-1β、TNF-α和Leptin之間明顯相關(見表1，圖1)。重型腦損傷組，腦損傷后第1天，腦組織中的IL-6、IL-1β、TNF-α的濃度與對照組相比顯著增高(P<0.05)，與中型組相似，第3天、第5天回歸至對照組水平，而Leptin在腦損傷后與對照組相比第1天顯著降低，第5天升至對照組水平，IL-6、IL-1β、TNF-α和Leptin之間無明顯相關(見表2，圖2)。

表1　中型腦損傷組各因子在傷后1、3、5 d腦組織中的濃度

表2　重型腦損傷組各因子在傷后1、3、5 d腦組織中的濃度

圖1　中型腦損傷組IL-1β，IL-6，TNF-α和Leptin在傷后1、3、5 d的關系　　　　　　圖2　重型腦損傷組IL-1β，IL-6，TNF-α和Leptin在傷后1、3、5 d的關系

3　討論

創傷性腦損傷能夠導致中樞神經產生炎癥反應，當腦外傷發生后，血腦屏障發生破壞，導致來自循環系統的大量白細胞聚集于中樞神經系統，這樣就使促使炎癥細胞激活并釋放大量的促炎癥因子，而這些因子(如IL-6、IL-1、TNF-α)有許多相似的生物活性，是許多重要炎癥反應的介導因素。Leptin與一些細胞因子有相似的結構，可能起到與炎癥因子相似的作用，因此，它被作為classⅠ細胞因子受體家族的一員，促炎癥因子(IL-1β、TNF-α)是Leptin的重要調節因子[6-8]。Leptin有脂肪組織合成分泌，不但參與炎癥反應的調節，而且具有減肥作用，其依靠參與下丘腦的調節軸，能夠降低食欲，增加熱量的消耗，而且對生殖、造血、血管再生、胃腸功能調節、交感神經調節、骨骼發育、大腦發育等均有一定作用，有研究表明[9-12]，Leptin有促進細胞增殖的作用。

我們的研究表明，中度腦外傷組的大鼠，其Leptin的表達水平增加與腦組織中的IL-6、IL-1、TNF-α的濃度有關，而重型腦外傷組，在傷后1～3 d 與IL-6、IL-1、TNF-α的濃度呈負相關，這意味著在重型腦損傷炎癥反應的早期Leptin蛋白的釋放受到抑制，而且當其他促炎癥因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)增加時，其表達水平下降。有報道[13-16]指出，在下丘腦-垂體軸未發育成熟的早產兒和下丘腦功能障礙的兒童中，Leptin蛋白的表達水平很低。RIGAUX等[7]發現，Leptin蛋白和異位骨骼形成均與嚴重腦損傷導致的下丘腦損傷有關。下丘腦損傷可能破壞了Leptin蛋白的抗成骨作用，從而導致異位骨骼的形成，本次研究中中型腦損傷組Leptin早期升高，可能是因為損傷后早期機體處于高代謝、低能儲狀態，游離脂肪酸產生增多，通過神經內分泌系統反饋調節升高Leptin水平；重型損傷組所出現的Leptin蛋白在早期的抑制，與重型顱腦損傷造成下丘腦的損傷有關。許多研究[17-22]表明，Leptin蛋白在炎癥反應和免疫調節過程中起重要作用，在感染和炎癥反應的情況下，Leptin蛋白水平增加，增強機體對炎癥反應的耐受能力。SHI等[9]的研究表明，在嚴重創傷發生后的早期，血漿中的Leptin蛋白水平下降，而其他細胞因子的表達增加(如IL-6、IL-1、TNF-α)，這意味著Leptin蛋白與這些因子在炎癥反應中起相反的作用，可能通過這種作用起到保護和修復的作用。在敗血癥、感染性休克等情況下[23-25]，血漿中的Leptin蛋白水平卻明顯增高，在慢性感染(如肺結核)和繼發性感染中的情況下，Leptin蛋白水平卻無明顯改變，這種調節Leptin蛋白的機制和其在不同疾病中的作用，目前尚未完全清楚。

我們的研究表明，Leptin的表達水平與腦損傷的程度有關，在重型腦損傷的炎癥反應早期Leptin蛋白的釋放受到抑制，而且當其他促炎癥因子(IL-6、IL-1、TNF-α)增加時，其表達水平下降。這意味著Leptin參與了腦損傷后炎性反應，而且可能發揮一定程度的抗炎和修復細胞因子的作用。若能進一步證實Leptin的診治價值，對于在顱腦損傷救治療將具有十分重要的意義。

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