AQP4表達對腦出血大鼠模型腦水腫與相關凋亡蛋白影響*

李美琪　曾偉靈　陶婉卿　孫玉紅

(1.西南醫科大學2014級臨床藥學專業； 2.西南醫科大學2014級藥學專業； 3.西南醫科大學2016級影像學專業； 4.西南醫科大學藥學院藥理教研室，四川 瀘州　646000)

腦出血具有極高的致死率及致殘率，在老年患者中尤為常見。腦水腫是腦出血后血腫周圍組織繼發性損傷，與血腫占位、繼發性缺血、自由基連鎖反應、炎癥反應、凋亡等病理生理變化可能有關[1]。水通道蛋白尤其是水通道蛋白4(Aquaporin4，AQP4)參與了腦水腫的形成和消退過程，起著調節細胞凋亡期間水穿過細胞膜的作用[2-3]。Rosenberg等研究發現AQP4在顱內出血后腦水腫的表達為一動態變化過程，腦出血后6 h血腫周圍組織AQP4蛋白明顯增加，出血后3 d達到高峰，以后逐漸下降[4]。腦出血組織損傷導致腦水腫與壞死和凋亡有關，Caspase-3以及Bcl-2作為主要的凋亡蛋白參與了腦出血的繼發性損傷[5]。在腦出血患者血腫周圍組織中Bcl-2蛋白表達降低，Caspase-3蛋白表達增加。但目前對AQP-4在腦水腫繼發性損傷中的作用與凋亡蛋白表達間有無關系目前尚不清楚，據此本研究提出能否通過干擾AQP4表達，影響腦組織周圍參與凋亡的蛋白表達，從而產生保護腦血腫周圍組織，減輕腦水腫與繼發性損害作用，為腦出血患者治療提供新的思路。

1　材料與方法

1.1　材料

靶向AQP4的siRNA表達質粒，引物(上海生工生物工程有限公司)，RT-PCR試劑盒(大連寶生物有限公司)；雄性SD大鼠(購自西南醫科大學動物實驗中心，生產許可證號：SCXK(川)2013-17)；β-actin，Caspase-3，Bcl-2兔抗大鼠單克隆抗體(abcam公司)；凝血酶Ⅶ(sigma公司)。

1.2　方法

1.2.1 大鼠分組及腦出血模型制備

將40只SD雄性大鼠隨機分為對照組、模型組、AQP4 siRNA組、空載質粒組，每組10只。通過腦立體定位后腦室內注射凝血酶Ⅶ0.5 U注射誘發尾殼核腦出血建立腦出血模型，注射部位為前囟后1 mm，矢狀線右側3 mm；進針深度約6 mm；凝血酶Ⅶ 0.5 U，勻速推注約5 min，留針10 min，出針5 min，總計20 min。模型組只建立模型，AQP4 siRNA組與空載質粒組分別在造模后同時注射siAQP410 μl(0.1μg)或siNC10 μl(0.1 μg)，質粒處理方法為1 μg與lipofectamine2000 100 μl混勻靜置20 min。

1.2.2 模型神經功能評定

術后1 d和3 d采用Longa分級法[6]進行神經功能評定。0分：無神經缺陷癥狀；1分：不能伸展手術對側前肢；2分：手術對側前肢屈曲；3分：輕度向手術對側轉圈；4分：嚴重向手術對側轉圈；5分：向手術對側跌倒。2分以上表示實驗模型成功。

1.2.3 腦組織含水量測定

術后第3 d處死大鼠，采用干濕重法測定腦出血灶周圍腦組織含水量：去除額極后，取病變側2 mm×2 mm厚腦組織測定含水量。腦組織濕重結果表示為A；將腦組織用錫紙包裹，放入烤箱內100℃烘干24 h后取出稱重為干重，表示為B；腦組織含水量=(A -B)/A×100%。

1.2.4RT-PCR法檢測血腫周圍腦組織AQP4 mRNA表達

AQP4引物序列為：上游5’-CCAGCTGTGATTCCAAAACGGAACAT-3’下游 TCTAGTCATACTGAAGACAA TACCTC-3’，產物大小305 bp。內參照β-actin引物序列為：上游5’-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3’；下游：5’-GAACCGCTCATT GCCGATAG-3’，擴增產物為375 bp。取血腫周圍腦組織50 mg冰上勻漿，Trizol裂解研磨，200 μL氯仿劇烈震搖30 s，4℃、12000 g低溫離心20 min，加等體積的異丙醇混勻，-20℃過夜，4℃、12000 g低溫離心20 min，經RT-PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析。AQP4 PCR條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 min，72℃延伸1 min，經32個循環后于72℃延伸10 min。β-actin PCR反應條件：預變性95℃2 min，變性95℃30 s，退火52℃30 s，延伸72℃40 s；35個循環后，最后延伸72℃5 min。

1.2.5Western blotting檢測血腫周圍腦組織Caspase-3以及Bcl-2蛋白表達

取血腫周圍腦組織100 mg，加入含有蛋白酶抑制的的細胞裂解液200 μl冰上裂解10min，4℃、12000 g離心10 min。BCA法測蛋白濃度后，采用8%分離膠和4%的濃縮膠分離蛋白，電泳時間120 min，之后加入Caspase-3或Bcl-2兔抗大鼠單克隆抗體(1∶500)，β-actin兔抗大鼠單克隆抗體(1∶2000)，4℃過夜，TBST洗膜3次，加入1∶1000羊抗兔多克隆抗體，37℃孵育2 h，洗膜，顯影，Image pro-plus 6.0軟件分析。

1.2.6 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，所有計量資料采用均數標準差表示，進行單因素方差分析，組間比較用SNK法，以P<0.05表示有統計學意義。

2　結果

2.1　各組大鼠模型神經功能評定

對照組為正常大鼠，因此神經功能評分為0。造模后1 d，與對照組比較，模型組和空載質粒組神經功能評分較高(P<0.01)，與模型組比較，AQP4 siRNA干預組評分較低，但比較無統計學意義(P>0.05)。造模后3 d，與對照組比較，模型組和空載質粒組神經功能評分較高(P<0.01)，與模型組比較，AQP4 siRNA干預組評分明顯降低(P<0.01)，見圖1。

圖1　造模后1 d、3 d大鼠神經功能評分注：與模型組比較，**P<0.01；與對照組比較，##P<0.01。

2.2　AQP4 siRNA干預后腦組織含水量測定

造模后3 d，大鼠腦組織出血明顯，腦組織出血周圍組織形成明顯腦組織水腫。模型組與空載質粒組含水量分別為79.9%和79.8%左右。與對照組比較，模型組與空載質粒組含水量較高(P<0.01)；與模型組比較，對照組與AQP4 siRNA干預組含水量明顯降低(P<0.01)，見圖2。

2.3　AQP4 siRNA干預后血腫周圍腦組織AQP4 mRNA表達水平

與對照組比較，模型組與空白質粒組大鼠腦組織出血周圍組織AQP4 RNA表達明顯增加(P<0.05)，與模型組比較，AQP4 siRNA干預組與對照組AQP4 mRNA表達明顯降低(P<0.05)，見圖3。

圖2　AQP4 siRNA干預后腦組織含水量注：與模型組比較，**P<0.01；與對照組比較，##P<0.01。

圖3　AQP4 siRNA干預后大鼠血腫周圍腦組織AQP4 mRNA表達注：與模型組比較，**P<0.01；與對照組比較，##P<0.01。

2.4　AQP4 siRNA干預后血腫周圍腦組織Caspase-3以及Bcl-2蛋白水平

與對照組比較，模型組大鼠腦組織出血周圍組織Caspase-3蛋白表達明顯增加而Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，AQP4 siRNA干預組Caspase-3蛋白表達顯著降低而Bcl-2蛋白表達顯著增加(P<0.05)，見圖4。

圖4　AQP4 siRNA干預后大鼠血腫周圍腦組織Caspase-3以及Bcl-2蛋白水平注：與模型組比較，**P<0.01；與對照組比較，##P<0.01。

3　討論

腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)是目前死亡率較高的疾病之一，然而機制未明[7]。通過腦內注射凝血酶Ⅶ誘發尾殼核腦的出血模型是經典的腦出血模型，具有出血時間快，出血點周圍水腫明顯，大鼠死亡率低等優點，因此較適合于研究腦出血后腦水腫的病理生理、生化改變及評價腦出血后神經功能的恢復狀況和藥物的治療效果的研究[8]。本研究通過腦立體定位儀定位，腦內注射凝血酶Ⅶ 0.5 U，結果顯示在注射后3天，腦出血較為明顯，大鼠神經功能出現明顯下降，造模較為成功。

水通道蛋白(Aquaporin，AQP)是一類形成所有生命形式的細胞屏障中膜轉移通道的蛋白質，是水的分子通道，它們容許水在細胞和它的周圍環境間運動。迄今在哺乳動物組織中已發現13種水通道蛋白(AQP0～AQP12)，其中水通道蛋白4在腦組織中含量豐富，主要分布于面向毛細血管內皮細胞、軟腦膜和腦室室管膜側膠質細胞的細胞膜或足突上，參與了腦水腫的形成和消退過程，在維持大腦水平衡，細胞凋亡期間水穿過細胞膜的運動等方面起著非常重要的調節作用[9]。腦出血損傷水腫可致AQP4表達增加，同時可能引起神經細胞及血腫周圍細胞損傷[10]。本研究通過購買AQP4siRNA質粒，干擾AQP4基因表達，結果顯示大鼠腦出血水腫較模型組和空質粒組大鼠均明顯減輕，提示AQP4參與了腦出血水腫過程。

細胞凋亡抑制蛋白Bcl-2與促凋亡因子，如Caspase家族都參與了腦出血患者細胞損傷。在腦出血患者血腫周圍組織中Bcl-2蛋白表達降低，機制可能為位于線粒體外膜的Bcl-2蛋白調節線粒體功能，抑制線粒體釋放促凋亡蛋白有關。腦出血患者Caspase表達增加，可激活特定信號系統，產生核皺縮、 DNA片段形成等凋亡現象，最終控制著細胞損傷的發生和發展[11]。

本研究結果顯示，siAQP4干預后，Caspase-3表達明顯降低而Bcl-2表達明顯升高，模型組與空白質粒組Caspase-3表達增加，Bcl-2表達降低，提示在抑制了AQP4表達后，促凋亡蛋白Caspase-3表達降低而抗凋亡因子蛋白Bcl-2表達增加，表明AQP4在腦出血導致的腦水腫和腦組織損傷中發揮的重要作用與凋亡蛋白的表達存在相關性。

綜上所述，在腦出血大鼠模型中抑制AQP4表達能抑制腦水腫，減輕腦出血大鼠神經功能損傷，可能與減少Caspase-3和增加Bcl-2表達有關，提示AQP4在腦出血水腫中的重要作用。

1Min H, Hong J, Cho IH, et al. TLR2-induced astrocyte MMP9 activation compromises the blood brain barrier and exacerbates intracerebral hemorrhage in animal models[J]. Mol Brain, 2015, 8(1): 1-14.

2Wu H, Zhao R, Qi J, et al. The expression and the role of protease nexin-1 on brain edema after intracerebral hemorrhage[J]. J Neurol Sci, 2008, 270(1-2):172-183.

3Rosenberg GA, Mun Bryce S, Wesley M, et al. Collagenase induced intracerebral hemorrhage in rats[J]. Stroke, 1990, 21(5): 801-807．

4Chiu CD, Chen CC, Shen CC, et al. Hyperglycemia exacerbatesintracerebral hemorrhage via the downregulation of aquaporin-4: temporal assessment with magnetic resonance imaging[J]. Stroke, 2013, 44(6): 1682-1689.

5代大偉,王德生,李克深,等. 局部亞低溫對大鼠腦出血后水通道蛋白4表達的影響[J]. 中華醫學雜志, 2006, 86(13): 906-910.

6趙曉勇,張曉麗,江向明. Ⅳ凝血酶結合自體血構建腦出血性腦水腫大鼠實驗模型[J]. 中華行為醫學與腦科學雜志, 2016, 25(10): 891-895.

7Adeli A, Behrouz R. The role of magnetic resonance imaging in management of patients with nonlobar hypertensiveintracerebral hemorrhage[J]. Neurohospitalist, 2015, 5(2): 59-62.

8郭富強,徐玉川,陳隆益,等. 腦出血患者血腫周圍組織水通道蛋白-4表達與腦水腫及病理超微結構變化的關系[J]. 中國危重病急救醫學, 2008, 20(11): 674-677.

9Sun Z, Zhao Z, Zhao S, et al. Recombinant hirud in treatment modulates aquaporin-4 and aquaporin-9 expression after intracerebral hemorrhage in vivo[J]. Mol Biol Rep, 2009, 36(5): 1119-1127.

10 Yuan D, Shen J, Yan Y, et al. Upregulated expression of SSTR1 is involved in neuronal apoptosis and is coupled to the reduction ofbcl-2 following intracerebral hemorrhage in adult rats[J]. Cell Mol Neurobiol, 2014, 34(7): 951-961.

11 秦峰,王長松,晉光榮,等. 犀角地黃湯對大鼠腦出血急性期Bcl-2、caspase-3、TNF-α、IL-6表達的影響[J]. 中國中藥雜志, 2009, 34(12): 1566-1569.