米曲霉基因工程技術的進展

張智敏 莊淼 金鋒杰

（南京林業大學 江蘇省南方現代林業協同創新中心，南京 210037）

米曲霉因其特有的生理生化性質以及安全無毒性，被美國食品藥品管理局（Food and drug adiministration，FDA）及世界衛生組織列為食品級安 全 菌 株（Generally recognizedas safe，GRAS）［1］，被廣泛用于食品、飼料、曲酸生產、釀酒等發酵工業和食品加工業。2005年，隨著米曲霉全基因組序列被破譯，標志著米曲霉全基因組時代的來臨，結合基因工程技術進一步推動了米曲霉的發展。與同源性較近的構巢曲霉和煙曲霉相比，米曲霉基因組要大7-9 Mb［2］，并且比釀酒酵母的基因組大25 Mb［3］。我們發現米曲霉相對于植物和哺乳動物具有較強的蛋白質分泌、合成能力以及快速生長，易培養等優點，與大腸桿菌和酵母相比也具有強大的翻譯后修飾功能［4］，因此被廣泛應用于細胞工廠生產多種酶制劑。另外米曲霉還可以用于生產次生代謝產物，如青霉素、曲酸等。當然在米曲霉外源表達過程中依然存在著一些不足，如mRNA的不穩定性［5］，錯誤折疊的外源蛋白被自身蛋白酶分解導致外源蛋白產量降低［6］。全基因組的破譯與隨之不斷發展的基因工程技術的有效結合為克服這些不足提供了可能，基于表達序列標簽（Expressed sequence tag，EST）的基因組學研究和DNA微矩陣技術的應用為深入研究米曲霉外源表達系統提供了條件［7］，推動了米曲霉外源蛋白表達系統的研究。這些不斷發展的基因工程新技術共同為今后米曲霉的研究鋪展了新的途徑，并為其工業應用奠定了理論基礎。

1 米曲霉轉化系統的基礎研究

在工業應用中，建立高效的遺傳轉化系統是應用米曲霉表達外源蛋白的前提。相對于酵母和大腸桿菌，米曲霉存在著堅韌的細胞壁，這對于后期轉化有一定的阻礙，因此常規的轉化方法不僅成本高，且效率低下，如電擊法、基因槍法。為了提高轉化率以及降低成本，目前普遍采用的是PEG/CaCl2介導的原生質體轉化方法［8］。

1.1 選擇性標記基因的應用

常見的營養缺陷標記基因，如pyrG、niaD、sC、adeA/adeB和argB等；致突型或建立特殊代謝途徑的標記基因，如amdS、ptrA等。其中最早開發建立也是目前應用最廣泛的是Mattern［9］開發的基于乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因（pyrG）的米曲霉轉化體系和Kitamoto［10］硝酸鹽還原酶營養缺陷型（niaD）轉化系統。之后通過UV變異以及基因敲除等技術構建了含有多個篩選標記基因缺陷株的米曲霉多重轉化系統，可以在同一菌株中進行多個基因的導入或刪除等基因工程操作［11-12］，為以后米曲霉的生產應用研究奠定了基礎。

1.2 染色體加工技術的開發及應用

在以往的對米曲霉的基礎研究當中，導致米曲霉基礎研究滯后的一個最主要原因是基因敲除技術，即同源重組轉化效率的低下。Takahashi等［13］通過敲除非同源末端連接（Nonhomologous end-joining，NHEJ）相關基因ku70、ku80和ligD等基因，大幅度提高了米曲霉的同源重組效率，從而提高了米曲霉的基因敲除效率。隨著同源重組效率的大幅度提高，Takahashi等還開發了染色體大片段刪除技術［14-15］，為后面大片段刪除染色體上不必要甚至有害片段提供了技術支持。由于米曲霉中依然存在著類似黃曲霉的毒素合成相關基因簇，盡管正常情況下是不表達的，但是也存在著一定的風險，通過大片段染色體的刪除技術可以將這些基因簇全部刪除。Jin等［16］在此基礎上對米曲霉第7條染色體進行了基因組縮短實驗，并成功地去除了大部分非必需的冗長片段以及毒素合成相關基因簇，不僅促進了淀粉酶的生產并且避免了一些對人體有害的副產物產生。以上這些技術的開發為今后米曲霉的生產利用開辟了一條新的途徑。

除此之外，米曲霉并沒有有性生殖，因此在生產應用方面具有一定的局限性。例如，不能通過有性雜交獲得更優良的生產菌株。Hara等［17］將第8條染色體縮短菌株與第7條染色體縮短菌株分別原生質體化并進行融合，獲得了兩條染色體同時縮短的融合體菌株。通過大片段染色體刪除技術結合原生質體融合技術，很有效的解決了這一困擾米曲霉研究者多年的問題，并為今后更好的進行染色體加工獲得優良菌株的選育提供了很好的技術手段。另外，利用大片段染色體刪除技術，Jin等［18］還發現了一個堿性螺旋-環-螺旋（basic helix-loop-helix，BHLH）家族轉錄因子SclR，研究表明SclR不僅能通過促進菌絲融合從而促進菌核的形成，同時還能有效促進細胞核之間的融合能力，為今后通過細胞核融合技術選育優良菌種提供了更大的可行性空間［19］。以上研究表明，染色體大片段刪除技術對于發現和探索功能基因的研究也具有重要價值。

2 米曲霉外源表達系統的研究

作為工業生產菌株以及近年來作為細胞工廠的廣泛應用，米曲霉外源蛋白表達的研究也越來越受人們的重視，如何優化外源表達系統對于米曲霉在工業上的應用意義深遠。通過分析米曲霉外源表達的優缺點，結合近年來不斷發展的基因工程技術，“揚長避短”共同提高米曲霉的外源表達。

2.1 降低米曲霉自身蛋白酶活性

與原核生物如大腸桿菌的生產/分泌系統相比，在米曲霉中表達的外源蛋白經歷真核翻譯后修飾，包括糖基化和蛋白質折疊等。由于這些原因，米曲霉被認為是表達高等真核生物蛋白的最突出的宿主之一［20］。外源蛋白生產很多限制因素，如轉錄水平、翻譯水平、分泌過程和細胞外降解等［21］。但是目前來說米曲霉自身的蛋白酶是抑制表達外源蛋白的最主要問題，因為外源蛋白相對同源蛋白更容易被蛋白酶分解。為了增加外源蛋白的產量，研究人員嘗試了各種生物學方法。例如，在低溫下進行下游處理、較早的將產物與蛋白酶分離、運用蛋白酶抑制劑等，這樣處理雖然可以減少水解作用，但是從效果來看并不樂觀，因為許多外源蛋白在蛋白產生的過程中就會發生降解［22］。Jin等［23］通過UV定向變異和選擇標記性基因敲除技術，獲得了具有腺嘌呤（Adenine）和精氨酸（Arginine）營養缺陷型的新性狀，最終構建多重營養缺陷型菌株，并通過構建酸性蛋白酶PepE和三肽酶TppA雙基因敲除菌株來表達外源人溶菌酶（Human lysozyme，HLY）基因，使酶產量提高20倍以上。Yoon等［24］在此基礎上連續敲除5個蛋白酶基因（tppA、pepE、nptB、dppIV和dppV），同時破壞5個蛋白酶基因顯示出外源蛋白牛凝乳酶（CHY）的產量比此前的雙基因敲除（tppA、pepE）提高了34%。Yoon等［11］又進一步利用選擇標記性基因pyrG可以反復循環使用的特點敲除了另外5個蛋白酶基因（alpA、pepA、AopepAa、AopepAd和cpI），結果顯示人溶菌酶和牛凝乳酶蛋白產量分別是參照株的3.2倍和3.8倍。為了更精準的探究影響外源蛋白分泌的蛋白酶基因，Yoon等［25］破壞編碼液泡蛋白分選受體的Aovps10基因，結果顯示CHY和HLY的最大細胞外生產水平分別提高了3倍和2.2倍，說明Aovps10在外源蛋白降解中起重要作用。之前研究蛋白酶基因（tppA，pepE）的雙重敲除菌株改善了人類溶菌酶（HLY）的生產，但是溶菌酶表達質粒由于其整合到基因組中而不能被去除，因此Nemoto等［26］重新構建了tppA，pepE破壞菌株作為外源蛋白質生產的宿主，通過UV變異分離出了HLY-超生產突變體。隨后，從突變體中除去含有溶菌酶基因的導入質粒，將得到的菌株命名為AUT菌株。Nemoto等利用AUT菌株進行外源蛋白生產，結果顯示HLY和CHY的產量分別比參照菌株高2.6-3.2倍。Yaver 等［27］研究發現當palB基因被破壞后，米曲霉的脂肪酶表達量增加。Zhu等［28］破壞三肽基肽酶基因AosedD成功獲得了轉化菌株，轉化菌株的CHY和HLY的最大產量分別比參照菌落提升了約2.9倍和1.7倍，這表明AoSedD在外源蛋白降解中起重要作用。緊接著Zhu 等［29］在原本高表達AUT1菌株中再敲除掉兩個Aovps10和AosedD，結果表明CHY和HLY的生產水平相對于AUT1菌株分別提高了1.6倍和2.1倍。

2.2 分泌外源蛋白路徑的優化

絲狀真菌分泌生產外源蛋白質常會受限于一些瓶頸問題：包括轉錄、翻譯、蛋白質折疊、易位、運輸和分泌等，外源蛋白的大量表達將導致內質網（Endoplasmic reticulum，ER）超負荷、蛋白折疊能力的下降以及激活未折疊蛋白質反應（Unfolded protein response，UPR）［30］。ER 折疊酶和分子伴侶（Molecular chaperones）相關基因的過表達可以部分緩解ER超負荷。例如，BipA和蛋白質二硫鍵異構酶（Protein disulfide isomerase，PDI）的基因過表達可以有效幫助提高外源蛋白生產［31-32］。而液泡蛋白質分選（Vacuolar protein sorting）、自體吞噬（autophagy）、內質網-高爾基體貨物受體（Endoplasmic reticulum-Golgi cargo receptors）相關基因也影響著米曲霉外源蛋白的生產［33-34］。

2.3 融合目標蛋白到內源性分泌酶載體蛋白

為了提高外源蛋白的表達量除了降低自身蛋白酶的活性，還可以將外源蛋白基因與自身高分泌蛋白基因融合表達［35］。目前研究表明將外源蛋白基因融合到米曲霉自身高分泌內生蛋白基因的末端，能有效的降低外源蛋白被米曲霉自身蛋白酶分解［36］。Ohno 等［37］通過比較CHY與自身淀粉酶基因融合和非融合基因的兩種米曲霉菌株，得出結論當將CHY與淀粉酶（AmyB）基因融合表達時，生產水平增加約2倍。Tsuchiya 將［38］小牛前凝乳酶 cDNA 片段與米曲霉葡萄糖淀粉酶基因（glaA）部分片段融合重組表達小牛凝乳酶，在浸沒培養中重組表達的凝乳酶是凝乳酶基因直接連到 glaA 啟動子下游表達量的5倍。

2.4 其他生物技術研究方法的應用

紫外線照射等引起的隨機突變是一種比較傳統有效提高絲狀真菌外源蛋白生產能力的方法。如前所述，使用HLY作為篩選指標，分離了米曲霉超生產突變株（AUT1-8）。我們進一步利用二代測序技術和比較基因組學，第一次在米曲霉變異菌株中成功確定了蛋白生產相關的變異位點［39］。誘變處理通常分兩個途徑：化學物理誘變和基因調控誘變。誘變處理是目前常用的研究方法，具有操作簡單成本低等特點，但是具有不可操控性。米曲霉全基因組的破譯和生物技術的發展，為人為通過基因調控米曲霉功能奠定了基礎。

Ham等［40］通過y射線的處理野生型米曲霉獲得四代穩定曲酸KA最高產量突變體，在麥芽提取物蔗糖培養基（MES）中，KA產量分別是其野生型菌株的2.03倍和1.9倍。人為敲除和反義RNA，可以達到基因調控誘變的目的。反義rRNA可以與mRNA分子特異結合，使mRNA分子沉默，從而抑制該rRNA的加工與翻譯。敲除一些功能基因能改變米曲霉某一功能以及部分表型，如提高部分酶的產量、菌核、菌絲的形態變化、色素的改變等［41］。Murthy等［42］利用UV處理米曲霉得到一個高產酸性蛋白酶的菌株，產量為親菌的5.6倍。Wang等［43］利用基因重組等技術獲得突變體菌株RIII-7，高果糖基轉移酶（FTase）活性180 U g-1是原始菌株的2倍，在發酵培養中，達到最大值353 U/g。

一直認為米曲霉沒有活性化轉座子（Transposon），近年發現其不僅有活性化轉座子（Tc1/marinertype transposable element）和反轉錄轉座子（LTR-retrotransposable element）的存在，而且在適當的條件下在米曲霉中可以產生多拷貝現象［44-45］。這一現象的發現有望今后在米曲霉中構建多拷貝外源蛋白生產菌株從而提高外源蛋白生產能力。

3 米曲霉次生代謝產物的分析

作為發酵生產菌株，米曲霉不僅能生產大量淀粉酶和蛋白酶，同時還能生產大量有用的次級代謝產物，但是這方面的研究進展相對緩慢。隨著近年大量曲霉菌基因組測序的展開，通過比較基因組學，可以預測一些物質的生產，而其中只有很少的一部分代謝產物的相關基因簇被掌握［46-47］。例如，通過基因組比較發現，在米曲霉中保留有生產青霉素的基因簇，而且保持非常高度的完整性，但產量極低。通過人為調控基因的高效表達，使青霉素的產量提高了100倍［48］。除了青霉素以外，米曲霉還生產曲酸等有用次級代謝產物［49］。綜上所述，盡管近年對曲霉菌次級代謝產物的研究已經取得了一定的進展［50-51］，但是還有很多未知領域等待進一步的發現。

4 問題及展望

米曲霉全基因組序列的破譯，為深刻理解米曲霉的遺傳背景和生產性能，快速挖掘其作為工業生產菌株的潛能，提供了豐富、可靠的遺傳信息，大力推動了米曲霉的相關研究。而隨后的米曲霉基因工程新技術的建立和快速發展，更是為其生產菌株的育種和工業生產利用開辟了更多可能的途徑。近年來的研究雖然一定程度上提高了米曲霉的外源蛋白酶制劑等有用物質的生產能力，但與預期還相差甚遠。

目前，除了上述外源蛋白表達中存在的瓶頸問題，還有以下一些問題需要進一步克服，如（1）酶提取過程中如何保證較高的活性；（2）部分強啟動子的導入，如cbh1啟動子會被葡萄糖和其它的容易利用的碳源抑制；（3）目前在工業生產中，大分子物質如麥麩、米糠、青貯飼料、玉米及豆粕等難以被米曲霉所利用，因此利用生物技術進行改良使其能降解吸收大分子物質，從而降低生產成本并減少原材料廢棄物帶來的污染；（4）大量產生的外源蛋白對于米曲霉本身會產生一定的不良影響；（5）在米曲霉生長后期存在反抑制調控，高濃度產物會抑制米曲霉的發酵生產。雖然Ichinose等［52］通過刪除單creA和雙creA / creB基因片段，在一定程度上提高了在高濃度誘導糖培養后期的淀粉酶活性，但效果并不明顯。

另外，盡管全基因組序列已經被破譯，但米曲霉大多數基因功能尚不明確，對其生產利用仍存在諸多限制。因此今后仍有很多未知功能基因和領域需要進一步的發現和探索。而近年逐步發展起來的組學新技術，如比較蛋白質組學及代謝組學等為今后功能基因的研究和蛋白分泌途徑的探索開創了全局性思維和新視野。綜上，如何將基因工程技術和米曲霉的生產應用完美結合，獲得高效生產菌株的育種，依然存在很大的空間有待今后更深入的研究和探索。