哮喘動物模型建立的研究進展

張睦涵 朱振剛

(1.天津中醫藥大學，天津 300193)(2.天津中醫藥大學第一附屬醫院呼吸科，天津 300193)

支氣管哮喘(bronchial asthma)簡稱“哮喘”，是一種由多種細胞組分及復雜細胞因子網絡參與的，對過敏性與非過敏性因素做出特異性反應的一種慢性氣道炎癥性疾病，被認為是造成醫療衛生高負擔的臨床最常見的慢性病之一[1]。哮喘防治的關鍵在于對哮喘發病各環節分子機制的深入研究，從而從病因學、基因水平研制出針對哮喘的靶向治療藥物，而新藥研究都需要進行前期細胞實驗和動物實驗，因此建立與人類哮喘病理生理及臨床變化高度擬合的哮喘實驗動物模型一直是哮喘實驗研究的基礎和中心環節,因此筆者查閱了最近10年有關哮喘動物建模及評價方面的有關文獻，從模型動物選擇及哮喘模型類型兩方面總結哮喘動物模型的研究進展，期望對哮喘的臨床及實驗研究有所裨益。

1 模型動物

1.1 小鼠

小鼠作為模型動物廣泛應用于人類多個系統的疾病研究中。小鼠的基因組背景純凈，品系豐富，生物學試劑及抗體完備且性價比高,可復制出哮喘經典的氣道高反應、氣道慢性炎癥、黏液增多等癥狀，有文獻報道成功復制小鼠氣道重構模型.故其雖有體積小，操作及取材較困難，造模需要多次致敏和激發等缺點，目前仍為支氣管哮喘研究最為常用的動物模型。常用的小鼠品系為BALB/c、C57BL/6，A/J、CBA、C3H等，以前兩種品系最常用。

1.2 大鼠

大鼠應用于哮喘造模研究不如小鼠充分，因為其雖然也有品系純，來源廣，價格較便宜等優點，且分子生物學試劑較多，標本采集量遠比小鼠充足，對致敏原激發反應較為一致，能出現與人類哮喘類似的速發相及遲發相變態反應，但大鼠模型在模擬人類哮喘嗜酸細胞脫顆粒等關鍵節點上差異較大，故目前對應用大鼠建立哮喘動物模型的科學性上存在較大爭議。

1.3 豚鼠

豚鼠哮喘模型是最早及最經典的動物哮喘模型，在1976年就有應用卵清蛋白(OVA)建立豚鼠哮喘模型的報道[2]，后來隨著研究的深入文獻報道很多，Ressmever等[3]也認為豚鼠在氣道藥理模型上比大鼠及小鼠更合適。但應用豚鼠建立哮喘動物模型的缺點也是顯而易見的。豚鼠的相關生物學抗體較少，敏感性強，個體反應差異大，導致出現不致敏或過度反應死亡的情況，影響造模成功率，且豚鼠價格較小鼠和大鼠而言較為昂貴，會導致研究成本的增加，故近年來豚鼠用于支氣管哮喘建模有逐步減少的趨勢。試驗豚鼠多數研究選擇雄性豚鼠，鼠齡25～35 d，體質量150～250 g，造模方法一般為：實驗第1 d腹腔注射10% OVA 1 mL致敏，2周后以1% OVA霧化激發誘喘，每日1次直至哮喘典型癥狀出現。李海銀等[4]應用OVA聯合弗氏佐劑致敏豚鼠建立了中性粒細胞哮喘的豚鼠模型。

1.4 其他動物

除目前常用的大鼠、小鼠、豚鼠外還有一些相對大型的動物可以選擇，例如貓可發生類似于人類慢性哮喘的支氣管疾病; 馬可以形成以中性粒細胞升高為主的呼吸道疾病，它有哮喘的一些特點，可能與慢性阻塞性肺疾病的聯系更加密切；已知羊和犬對某些變應原天生就敏感[5]，猴的免疫系統和人非常相似，但是存在動物來源及實驗成本的限制，研究與應用都相對較少。

2 模型類型

2.1 過敏性哮喘模型

過敏性哮喘動物模型是目前研究最廣泛，也是與人類哮喘病理生理機制最接近的哮喘模型類型。過敏性哮喘的造模劑常有卵清蛋白、花粉和有機粉塵等，其中卵清蛋白致敏研究最充分，模型最成熟，不再贅述。季節性哮喘的誘因主要是花粉和真菌蛋白等致敏，建立此類模型對研究變應性哮喘有很大意義。李雅莉等[6]應用蓬草花粉粗浸液致敏激發的BALE /C小鼠建模，具體方法為:首先于第一天腹腔注射300μg蓬草花粉粗浸液加氫氧化鋁凝膠2 mg致敏，之后第7、14天后加強致敏，第24天給予30 μL(10 g/L)蓬草花粉粗浸液滴鼻激發，每日1次，連續5次激發。在有機粉塵致敏方面，應用于誘發支氣管哮喘模型研究較多的是屋塵螨及蟑螂。最近國外相關屋塵螨所致哮喘模型的建立方法都是以鼻內滴入屋塵螨3～6周[7-8]，朱艷芬等[9]研究了不同濃度致敏激發下小鼠支氣管哮喘氣道重構模型，其存在明顯的劑量效應關系及時效關系，結果顯示高濃度屋塵螨提取物處理9周時氣道重構表現最為明顯。

2.2 感染性哮喘模型

感染性哮喘的經典模型是應用呼吸道合胞病毒(respiratory syncyialvirues，RSV)，內毒素、脂多糖等致敏。蔣雄斌等[10]研究表明，RSV感染可致OVA致敏激發的哮喘小鼠呼吸道炎癥明顯加重，氣道高反應性及其時間明顯延長。張雷英等[11]研究了時期因素對哮喘模型的影響，發現致敏前感染RSV明顯抑制OVA誘導的肺部炎癥，但致敏后感染RSV則對OVA誘發的氣道變態炎癥無明顯影響。Newcomb等[12]則發現IL-17 A基因敲除的小鼠比野生小鼠在經OVA及RSV致敏激發的過程中表現出了更強烈的氣道高反應性和氣道炎癥癥狀。

2.3 職業性哮喘模型

職業性哮喘的定義是由工作場所特定的環境因素所誘發的哮喘病癥，其臨床癥狀和其他哮喘類型相似，表現為可逆的氣道阻塞，非特異性氣道高反應性。流行病學調查認為哮喘發病率上升和過去數十年工業化進程加速導致的職業暴露密切相關。而各種各樣的環境因素，特別是大量的富含可吸入蛋白的人造化合物和環境污染物，被認為是導致職業性哮喘的主要誘因[13]。有證據表明環境抗原能造成非特異性血清IGE升高，這被認為和其引起的哮喘癥狀相關。Tarkowski等人用2.0 mg/m3的氣態甲醛預處理BALB/C小鼠10 d，每天6 h，小鼠產生的血清(其他過敏原)特異性IGE較未處理組抗體含量提高3倍。

2.4 肥胖哮喘模型

隨著國民飲食結構的嬗變，肥胖人群比重不斷上升，相關健康問題也引起學術界注意。肥胖在哮喘發生、發展中的作用逐漸受到重視[14-15],2006版GINA將高體塊指數列為哮喘的獨立危險因素之一。國外多采用基因缺陷或高脂飲食誘導建立肥胖動物哮喘模型，以進行相關研究[16]。但人類多為單純性肥胖引起哮喘癥狀，故前者有一定局限，而后者所用純化配方飼料具有造價高的問題[17]。我國學者夏宇和黃英[15]采用不含致敏原的自制高脂飼料喂養、卵清蛋白致敏激發C57BL/6 J小鼠，成功建立了肥胖哮喘動物模型。

2.5 中性粒細胞性哮喘模型

嗜酸細胞在哮喘發病中的中心地位已廣為人知，然而最近的研究提示中性粒細胞(neutrophil,NEU)在哮喘炎癥浸潤過程中也有重要影響。Douwes等[18]發現約50%的哮喘患者存在氣道NEU浸潤，且NEU與重癥哮喘[19]、遲發型哮喘[20]、激素不敏感型哮喘[21]有密切聯系。2006年Simpson 等[22]將誘導痰中中性粒細胞百分比(NEU%)>61%的哮喘患者定義為中性粒細胞哮喘(neutrophilicasthma,NA)。諸多學者從各個方面嘗試復制中性粒細胞哮喘動物模型。迄今為止，OVA是制備中性粒細胞哮喘動物模型最常用的致敏原，有單純OVA和復合OVA(含佐劑)兩種，以復合OVA較常用。除了致敏原以外，細菌內毒素(LPS)[23]、環境污染[24]、香煙煙霧[25]、支原體感染[26]等許多非過敏性因素也可導致哮喘患者或小鼠氣道NEU增多，活性增強，并與AHR有關，因此通常采用OVA聯合非過敏因素建立中性粒細胞哮喘實驗動物模型。

2.6 難治性哮喘模型

哮喘患者中有一組人群，我們稱之為難治性哮喘。這里所說的難治，并不是說所有嚴重的，甚至危及生命的哮喘類型，而是指當使用最大推薦劑量的吸入治療后，仍未有效地控制的哮喘。難治性哮喘約占整個哮喘人群的20%。但這類人群所花費的費用占整個哮喘人群的80%[27]。關于難治性哮喘模型的復制目前尚無權威方案。徐世軍等認為過敏性豚鼠哮喘模型結合變應原反復刺激造模、過敏性豚鼠哮喘模型結合反復呼吸道感染造模、過敏性豚鼠哮喘模型結合呼吸道合胞病毒等病毒感染造模及過敏性與運動性哮喘相結合造模等思路有望成功復制難治性哮喘模型。

2.7 哮喘氣道重塑模型

氣道重塑是哮喘慢性化后面臨的重要問題，和激素抵抗、哮喘反復發作、哮喘-慢阻肺綜合征等相關。哮喘氣道重塑是一個不斷發展的過程，從炎癥細胞浸潤到氣道內腺體的增殖和肥大，最終導致基底膜和氣道平滑肌增厚，引起不可逆性氣流受限和非特異性的氣道高反應性[28]。氣道重塑的發生代表哮喘病程從炎癥性病變到結構改變的轉化趨勢，目前來看涉及分子機制較為復雜，是哮喘研究的挑戰之一[29]。因此復制與人類哮喘氣道重塑病理特征相似的動物模型也是哮喘實驗研究的重要組成。陳寶生等[30]以雄性豚鼠作為實驗對象，通過卵清蛋白腹腔注射致敏霧化吸入激發的方法復制哮喘氣道重塑動物模型。采用連續10周霧化的長程干預措施后發現豚鼠出現血氧分壓降低，提示氣道重塑模型復制成功。

2.8 激素抵抗型哮喘模型

隨著糖皮質激素在臨床上的廣泛應用，以及環境、精神、心理等因素的影響，部分哮喘患者哮喘癥狀反復發作，并對糖皮質激素的敏感度明顯降低，因此一種新的哮喘類型-激素抵抗型哮喘(steroid resistant asthma，SRA)也得到廣泛的關注，建立SRA動物模型的方法也在積極的研究中[31]。研究人員發現，持續的抗原暴露、激素治療不合理中斷可影響支氣管哮喘的控制[32-33]。文莎和吳峰[34]通過普通級BALB/C雌性小鼠采用卵清白蛋白(OVA)致敏、激發造模，予地塞米松干預并連續霧化9周，結果成功復制激素抵抗型小鼠哮喘模型，說明反復抗原刺激聯合地塞米松中斷性干預建立小鼠SRA模型的方法切實可行。

3 結語

基于近十年國內外支氣管哮喘動物造模方面相關研究可以發現，小鼠是哮喘動物模型建立中最常使用的動物。過敏性哮喘是被最充分復制的哮喘模型，其病理生理學變化研究最為充分。卵清蛋白致敏、激發是最常用的哮喘造模方法。不少學者也注意到支氣管哮喘疾病本身的異質性，激素抵抗哮喘、中性粒細胞哮喘等基于哮喘表型的分類方法也影響了哮喘動物模型的研究。哮喘實驗動物模型的研究趨于細化，對哮喘氣道重塑、難治性哮喘的動物模型研究也從無到有。隨著有機粉塵暴露的增加，越來越多的職業相關性哮喘動物模型被成功復制。今后的哮喘動物模型研究必將沿著與臨床更加緊密、結合哮喘表型、結合基因工程學研究的道路不斷前進。