漢灘病毒新型疫苗研究進展

董兆昱，郭雷鳴，程林峰

空軍軍醫大學基礎醫學院 微生物學教研室，陜西 西安 710032

漢灘病毒（Hantaan virus，HTNV）在我國主要引起腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with re?nal syndrome，HFRS），是由鼠類傳播的一種急性病毒性傳染病[1]，臨床上以發熱、出血、急性腎功能損害和免疫功能紊亂為主要特征[2]。HFRS流行于世界上近40個國家和地區，我國是HFRS疫情最嚴重的國家之一，主要表現在流行范圍廣、發病人數多、病死率較高。HFRS的傳染源和宿主動物廣泛，傳播途徑多樣，主要危害青壯年，臨床上尚無特異有效的治療藥物，因此在我國HFRS的防治任務十分艱巨。

目前我國已研制出HTNV滅活疫苗，其推廣使用對預防HFRS的發生和流行起到了積極作用。但該類疫苗仍存在一些問題，主要是不能有效刺激細胞免疫應答，誘導機體產生中和抗體的能力也較弱，抗體滴度不高等，因而研發新型HTNV疫苗成為當務之急。我們僅就近年來國內外HTNV新型基因工程疫苗的研究進展做簡要綜述。

1 HTNV基因組及其結構蛋白

HTNV顆粒由核心和包膜組成，其基因組位于核心部分，為單股負鏈RNA。HTNV全基因組由11845個核苷酸組成，包括M、S、L共3個基因片段[3]。M基因全長約3.7kb，只有一個長開放讀框（openreadingframe，ORF），長度約 3.4kb，編碼2個糖蛋白Gn和Gc的前體蛋白，前體蛋白中部有一個由5個氨基酸殘基（WAASA）組成的共翻譯切割點，在細胞內質網內將前體蛋白切割成Gn和Gc蛋白，相對分子質量分別為72000和55000[4]。HTNV的Gn和Gc的結構和功能決定了病毒的生物學特性，因此成為當前最受關注的研究熱點。Schmaljohn等[5]發現HTNVGP上共有7個N糖基化位點，其中Gn上有5個天門冬酰胺連接的糖基化位點，Gc上有2個；研究還發現Gn和Gc上分別含有3個和1個保守型糖基化位點，這些糖基化位點對于維持病毒的生物學特性至關重要。HTNV的Gn和Gc上存在諸多中和抗原位點和血凝抗原位點，能刺激機體產生中和抗體，對感染動物和HFRS患者有保護作用，因此成為HFRS基因工程疫苗研究的重要抗原蛋白[6]。徐志凱等[7]采用多株單克隆抗體（monoclonalanti?body，mAb）對HTNV的結構蛋白進行分析時發現，GP上不僅存在獨立的中和抗原位點和血凝抗原位點，也存在一些具有雙重功能的位點。

S基因全長約1.7kb，包含一個長ORF，長度約1.3kb，編碼相對分子質量約為50000的非糖基化蛋白NP[8]。HTNVNP的主要功能是包裹病毒基因組，該蛋白C端的高度保守序列可識別病毒基因組非編碼區基因并與之結合形成復合體，該復合體與RNA聚合酶一起組成病毒顆粒的核心。HTNVNP上含有多個特異性抗原位點。徐志凱等[7]采用10株mAb對HTNVNP做抗原位點分析時，發現NP上至少有12個抗原位點，其中7個組特異性抗原位點和1個亞組特異性抗原位點主要分布在2個區域內，其他抗原位點則可能與上述抗原位點的分布有部分相同或重疊，這些抗原位點的重疊有些表現在一級結構上，有些則表現在空間結構上[9]。HTNVNP具有很強的免疫原性，可以誘導機體產生強烈的細胞和體液免疫應答，所以也成為HTNV新型基因工程疫苗研究中的重要抗原蛋白。

L基因全長約6.4kb，非編碼區較短，為36～43 bp，含有一個長ORF，編碼病毒RNA依賴的RNA聚合酶，相對分子質量約250000，與病毒復制和轉錄有關，并非病毒的結構蛋白[10]。HTNVRNA聚合酶分子很大，很難在大腸桿菌等表達系統中表達，所以目前關于其生物學活性的研究很少。

2 HTNV亞單位疫苗

亞單位疫苗是指在原核或真核細胞中表達保護性抗原基因，并將表達產物（蛋白質或多肽）制成疫苗。其優點在于安全性和穩定好，純度比較高，便于大規模生產。

多項研究表明，利用大腸桿菌表達系統[11-12]、酵母表達系統[13-14]和桿狀病毒表達載體系統（baculovirus expression vector system，BEVS）[15-16]等均可表達HTNV的NP或GP，并具有較強的抗原性，免疫動物后也取得了良好的保護效果。Figueiredo等[17]通過大腸桿菌BL21構建了能表達HTNVNP的重組原核表達載體，將表達的NP免疫小鼠后，在其血清中可以檢測到針對NP的特異性抗體，證明表達的NP可作為HTNV的抗原蛋白加以研究和利用。Petraityte等[13]利用釀酒酵母表達系統穩定地大量表達了HTNVNP，將其用于ELISA檢測HFRS患者血清中的抗HTNVIgG和IgM抗體，特異性和準確性分別達98%和99%，證明表達的NP具有良好的抗原性。Yoshimatsu等[18]用BEVS表達了HTNVNP和GP，將表達的NP或GP免疫小鼠后收集其血清或脾細胞并注射入小白鼠乳鼠，結果發現可以部分保護乳鼠抵抗致死性的HTNV攻擊。Schmaljohn等[19]利用BEVS分別表達HTNV的NP和GP以及單獨表達Gn和Gc，并對其免疫學特性進行研究，結果證實所有表達的重組抗原蛋白均能有效刺激機體產生特異性免疫應答，并且全GP蛋白的免疫效果要強于Gn和Gc單獨免疫的效果，動物保護實驗發現所有抗原蛋白對乳鼠均有全部或部分抗HTNV攻擊的保護作用。Yoon等[11]發現大腸桿菌中表達的全長或截短的HTNVNP在體外被酪蛋白激酶Ⅱ（casein kinase，CKⅡ）磷酸化，位點特異性誘變研究表明HTNVNP磷酸化可能發生在位點直接誘變的位置以外的未知位點。Ma等[20]通過IEDB（表位預測和分析工具最全面的集合）選擇15個8-mer肽，用IFN-γELISpot測定，在HTNV感染的小鼠的脾細胞中鑒定出新的GP衍生的CTL表位GP6 aa456～aa463，ELISPOT和細胞介導的細胞毒性測定顯示該肽疫苗在免疫小鼠中誘導強的IFN-γ應答和有效的細胞毒性H2-Kb限制性CTL表位，表明HTNV亞單位疫苗具有臨床應用價值。Ma等[42]發現FA9（HTNV核蛋白CD8+T細胞表位aa129～aa137）與 HLA-A*0201復合物顯示典型的MHCⅠ類折疊，誘導Tg小鼠IFN-γ、TNF-α、粒酶B和CD107a的高表達水平，表明FA9可以用于開發HTNV肽段疫苗。

雖然目前關于HTNV亞單位疫苗的研究取得了長足進展，但也遇到了一些瓶頸問題，例如如何提高HTNV抗原蛋白尤其是GP的表達量，如何有效分泌和正確修飾重組抗原蛋白，如何純化并保持抗原蛋白活性，以及如何增強其刺激機體的免疫應答能力等。若能有效解決這些問題，將會大大促進HTNV亞單位疫苗的進一步發展。

3 HTNV核酸疫苗

核酸疫苗又稱為DNA疫苗或基因疫苗。通常以質粒DNA為基礎，即將抗原基因克隆入質粒DNA構建重組質粒，該重組質粒可以在真核細胞中表達相應抗原，其在體內的抗原提呈過程與病毒感染相似，因此能夠刺激機體產生特異性的免疫應答，尤其是以CTL殺傷功能為主的細胞免疫應答。同時由重組質粒編碼的蛋白抗原在體內可以維持更長效的免疫刺激，能夠有效地預防病毒等引起的傳染病。核酸疫苗的制備工藝簡單，易于保存，同時可以避免出現毒力返祖、人群之間傳染及污染環境等危險，安全性高，因此成為研發病毒疫苗的有效策略[19]。

Hooper等[21]將HTNV的M全長基因克隆入pWRG7077表達載體構建了重組核酸疫苗，用基因槍注射倉鼠后，可以有效保護倉鼠免受HTNV的攻擊，而且這些免疫倉鼠還可以抵抗同樣引起HFRS的漢坦病毒屬的另外2個型別的病毒，即多布拉伐-貝爾格萊德病毒（Dobrava-Belgradevi?rus，DOBV）和漢城病毒（Seoulvirus，SEOV）的攻擊；將該重組核酸疫苗免疫恒河猴，可在猴血清中檢測到高滴度的中和抗體，這也是首次關于HTNV核酸疫苗免疫靈長類動物的研究報道。張芳琳等[22]用真核表達載體pcDNA3.1構建了含有HTNVGc和S0.7kb基因的嵌合重組核酸疫苗并用其免疫小鼠，結果在小鼠血清中可檢測到針對Gc和NP的高滴度的特異性抗體以及低滴度的中和抗體，同時發現免疫小鼠的T淋巴細胞增殖能力強于正常小鼠，表明所構建的嵌合重組核酸疫苗可以有效刺激機體的體液免疫和細胞免疫應答。Woo等[23]利用真核表達載體pcDNA3.1構建了含有HTNVNP的重組核酸疫苗，免疫C57BL/6小鼠后可以刺激其產生針對NP的特異性抗體以及NP特異性的CD8+T細胞應答，并可以保護小鼠免受HTNV的攻擊。Jiang等[24]通過特異性抗體檢測和微量細胞中和實驗，以及IFN-γELISpot和CTL毒性殺傷實驗來評估BALB/c小鼠對基于Gn的DNA疫苗的免疫應答，發現該DNA疫苗可以刺激機體產生較強的細胞和體液免疫應答，且疫苗具有長期保護作用。

此外，多個研究小組還研究了不同型別的漢坦病毒的核酸疫苗，包括 HTNV[15,21,23]、SEOV[25-26]、PUUV（Puumalahantavirus）[27]、ANDV（Andesvi?rus）[28-29]與 SNV（Sin Nombre hantavirus）[30-31]，這些研究顯示構建的核酸疫苗在倉鼠、小鼠或獼猴等實驗模型中均能誘導特異性的體液免疫應答，并對動物具有保護作用。因此，有研究者試圖通過將這些重組核酸疫苗進行混合來研發HFRS多價疫苗。然而，Spik等[32]發現，將HTNV和PUUV的核酸疫苗通過基因槍分別注射小鼠時，可以刺激產生分別針對HTNV和PUUV的特異性抗體應答，但是將二者混合后注射小鼠時僅能刺激產生針對PUUV的特異性抗體應答，他們認為這可能是不同的核酸疫苗之間存在相互干擾所致。Bou?dreau等[33]進一步研究發現，當通過肌肉電轉的方式接種混合疫苗時可以減少這種干擾，免疫后小鼠體內可以檢測到分別針對HTNV和PUUV的特異性抗體應答。關于基因槍注射與肌肉電轉在應用于核酸疫苗免疫時的孰優孰劣還須更深入的研究。McCoy等[34]發現HTNV與PUUV核酸疫苗單獨或作為組合通過多頭皮內電穿孔裝置注射，不需要預先篩選組合疫苗，可以減輕遞送時的負面效應，降低免疫應答的風險。

4 HTNV病毒活載體疫苗

病毒活載體疫苗是指將外源目的基因片段重組于病毒載體中，重組后的病毒載體導入機體后即可表達目的蛋白，通過刺激機體產生特異性的免疫應答來達到預防某種疾病的目的。這類疫苗的優點是安全性好，技術較為成熟。目前常用的病毒載體主要包括逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體及痘苗病毒載體等。

多項研究證實用HTNV重組活載體疫苗免疫后的動物可以有效抵抗HTNV的攻擊。Chu等[35]將編碼HTNVGP和NP的基因克隆到痘苗病毒載體中構建重組痘苗病毒，用其免疫地鼠后可產生針對HTNV的中和抗體；再用HTNV攻擊免疫后的地鼠，并采用RT-PCR方法檢測地鼠肺臟和腎臟中的HTNV核酸，結果均為陰性，表明用HTNV重組痘苗病毒免疫可使地鼠獲得有效的保護。Yu等[36]構建了帶有HTNVGP和rLV-M的重組假型慢病毒，用rLV-M免疫C57BL/6小鼠，動物保護實驗顯示該疫苗可有效保護小鼠免受病毒攻擊。Cheng等構建含HTNVGn和NP0.7kb片段（NPN端1～274aa）的重組腺病毒并用其免疫C57BL/6小鼠，發現可刺激機體產生有效的體液和細胞免疫應答，中和抗體滴度達1∶40，而滅活疫苗對照組小鼠的中和抗體滴度僅為1∶20；進一步用HTNV攻擊免疫后的小鼠，并采用ELISA檢測小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦等臟器組織中的病毒特異性抗原，結果均為陰性，表明用HTNV重組腺病毒免疫可使小鼠獲得有效的保護[37]。

雖然活載體疫苗可有效刺激機體產生特異性免疫應答，并保護動物免受病毒的攻擊，但是其最大的缺點是接受疫苗接種的個體體內預先存在的抗病毒載體抗體會影響活載體疫苗的免疫效果。Schmaljohn等[38]通過構建含有HTNVGP和NP的重組痘苗病毒免疫地鼠和沙鼠后取得了很好的保護效果，但該疫苗后續的Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗發現，對痘苗病毒抗體陰性的志愿者接種后100%產生了針對HTNV的特異性中和抗體，而先前體內存在痘苗病毒抗體的志愿者接種后僅有50%能產生針對HTNV的特異性中和抗體[39]，再加上活載體疫苗本身潛在的副作用風險，使得該疫苗的研制工作最終擱淺[40]。

5 HTNV病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒（virus-likeparticle，VLP）是由病毒的一種或多種結構蛋白組成的不含病毒核酸的空心顆粒。這些VLP可以自我組裝，與天然病毒的空間結構高度相似，因而保持了病毒抗原蛋白的天然構象并具有很好的免疫原性；同時由于不含病毒核酸，不能自我復制，因而不會出現毒力返祖，無感染風險。因此，VLP是研制HTNV基因工程疫苗的一種安全、高效的候選疫苗。

目前關于HTNVVLP疫苗的研究還比較有限，但已有研究表明HTNV的結構蛋白可以自我組裝形成VLP，并且具有良好的免疫原性。如Betenbaugh[33]等利用BEVSpFastBacDual分別構建了含有HTNVM及S基因的rBV，將rBV共感染Sf9昆蟲細胞制備了HTNVVLP，免疫小鼠后可刺激機體產生較高滴度的中和抗體。Li[35]等利用真核表達載體VH-dhfr/A9構建了含有HTNVM及S基因的重組質粒VH-dhfr/A9M及VH-dhfr/A9S，并通過共轉染中國倉鼠卵巢（CHO）細胞的方式制備了HTNVVLP，用其免疫小鼠后可以刺激機體產生較強的體液免疫和細胞免疫應答。Cheng[41]等將GPI錨定形式的GM-CSF或CD40L整合到HTNVVLP中以產生嵌合VLP，發現GM-CSF和CD40L摻入HTNVVLP誘導高水平的體液和細胞免疫應答，并保護C57BL/6小鼠免受HTNV攻擊。

VLP作為基因工程候選疫苗，不僅僅用于HTNV疫苗的研制，也廣泛應用于其他病毒疫苗的研制。目前VLP疫苗研制工作中最關鍵的問題在于如何大量表達和純化VLP，因此選擇一種合適的表達系統顯得尤為重要。

6 結語

綜上所述，HTNV新型基因工程疫苗的研究雖然取得了一些進展，但是距離實際應用還相差很遠。目前存在的主要問題包括目的蛋白的表達量還不高，各表達系統（產物）刺激機體的免疫應答水平還不理想。因此，進一步篩選和優化組合有效的保護性抗原，進一步選擇合適的表達載體并優化表達系統，并聯合應用免疫佐劑，以提高目的基因刺激機體免疫應答的能力，都值得深入探索。

參考文獻