如何提高病毒外源因子檢測中小鼠和乳鼠檢查法的成功率

馮學軒 鐘志勇 嚴家榮 黎莉斯 鄺少松

(廣東省醫學實驗動物中心，廣州 528248)

隨著醫藥研究的發展，生物制品在臨床上的使用率日趨上升，且應用范圍日益廣泛，在使用頻率和使用人群不斷上升的情況下，安全性問題隨之而來。生物制品大多使用動物血清、細胞基質、蛋白酶等進行選育、培養，且生產過程中人工操作等影響因素較多，因此十分容易受到外源的病毒、微生物，包括細菌、真菌、支原體、螺原體、分枝桿菌、立克次氏體、原生動物、寄生蟲、朊粒及病毒(包括細胞系/株本身攜帶的逆轉錄病毒和外界污染的病毒)等的污染[1-2]，且一旦受污染的制品流于臨床，容易導致使用者出現生命危險，或引發流行性疾病，后果不堪設想。因此，對于生物制品，如病毒類制品，細胞制品等的安全性均要進行嚴格的把控。

目前，無論是WHO、歐盟、美國 FDA，還是我國藥典，均對疫苗外源病毒污染檢測和控制有嚴格要求[3]。2015年版中國藥典三部通則里，也參照歐洲藥典對外源因子的檢測作了規定[1]。但規定中的一些細節問題及操作方法也未作明確描述，加上病毒類外源因子感染細胞后短期內無明顯特征，因此肉眼難以分辨，若在外源因子的檢測過程中操作不當，或者供試品給予劑量不準確等，則將容易導致假陰性或假陽性的結果[4]。

在外源因子的檢測方法中，對于小鼠法和乳鼠法，筆者通過多次的驗證、探討，對于如何提高實驗的準確性及成功率，具有一定的心得，特作以下的經驗總結。

1 供試品的前處理

取樣時應遵循隨機、足量及最大限度暴露毒性的原則。具體可參照2015版中國藥典三部通則3302關于供試品制備原則的相關要求。若受試樣品為細胞或細胞上清液，細胞應盡量在原單位生產后盡快接種，細胞上清液則采用原液接種，無特殊情況，盡量不作稀釋[5]。

2 小鼠法和乳鼠法中腦內接種的方法

小鼠法和乳鼠法均需要腦內接種與腹腔接種，其中腦內接種方法難度稍大，接種時是否漏液，會否影響動物的存活率等因素對實驗結果的判斷有著至關重要的影響。

2.1 小鼠腦內接種操作方法的選擇

小鼠腦內接種時，常用兩種方法，一種方法是從眼窩后方，眼角處往斜上方進針，有落空感后停止進針，注射藥液；另一種方法是從兩眼連線的正中間垂直進針，刺破頭骨后停止進針，注射藥液。有文獻報道第一種方法對小鼠影響較小，但個人實踐后發現，第一種方法由于各鼠間的進針深度受每次操作時進針的角度、力度等影響，即便同一人操作，也難以做到操作上的一致性，由此導致各鼠間在給藥過程中就存在著較大差異。筆者曾嘗試在針柄處套上橡膠套以固定進針深度，但每只動物體型上的差異會導致其進針深度存在一定的個體差異，因此最適宜的進針深度并非完全一致。此外，此法的進針深度較大，且進針后，由于針頭與顱頂呈一定角度，一旦控制不好，十分容易損傷腦組織，影響動物健康。因此，筆者建議采用第二種注射方法：從兩眼連線的正中間垂直進針。此法進針較淺，且垂直進針，操作簡單，只要針尖斜面沒過頭骨即可注射，加之同一體質量段的各鼠顱骨厚度差別較小，因此進針深度較為一致，可采用針柄處套橡膠套的方法固定進針深度，這樣各鼠間的偏差較小，且對小鼠顱腦組織影響較小，安全易行。

2.2 小鼠腦內接種操作要點

注射時使用50 μL或100 μL的微量注射器，操作時需注意：首先，須在針柄上套一橡膠管套以控制每次的進針深度，避免力度控制不穩，進針過深，損傷腦組織，深度一般以沒過針尖斜面1～2 mm即可。其次，捉取動物時，左手拇指與食指從兩耳稍往前捉緊動物頭部皮膚以固定頭部，避免動物頭部動彈而影響注射。此外，注射完畢后，快速直接拔針，不旋轉針頭，以免損傷腦組織。拔針后左手兩手指迅速往前推動，捏緊注射部位的針口數秒，以防漏液。最后，注射時，應勻速，且速度切勿過快，以免動物因顱內壓急劇升高而至死亡，且應一次注射完畢，避免二次注射。

2.3 乳鼠腦內接種操作要點

乳鼠腦內接種時，針柄同樣需套一橡膠管套以固定進針深度，但橡膠管只需固定至針尖斜面上約0.05 mm，不超過1 mm。捉取乳鼠時，將乳鼠側臥，自眼睛與耳朵連線中點發白處進針，進針深度以沒過針尖斜面約0.05 mm即可，過淺則漏液，過深乳鼠則容易死亡。注射時也應緩慢勻速，避免顱內壓急劇升高。注射完畢后同樣直接拔針，并迅速以棉花壓迫注射部位，以免漏液[6]。需注意的是，由于乳鼠較小，且易動，注射時注意固定動物及避免針頭動彈，必要時可一人捉取動物及固定微量注射器，另一人負責緩慢推針。

3 乳鼠試驗法中如何避免母鼠吃仔

由于2015版中國藥典規定乳鼠試驗法中需采用出生24 h內的乳鼠，大多數情況下，由于母鼠剛生產，對人員及外界環境較為敏感，一旦受驚嚇，則容易引起母鼠吃仔的情況發生，且人員操作完畢后，乳鼠身上若殘留有人員的氣味，更容易出現母鼠吃仔的問題。因此，如何防止母鼠吃仔，成為了乳鼠試驗法是否成功的關鍵。

實驗時，若需將窩鼠移動至實驗場所，則移動時動作應輕柔，避免移動過程顛簸，移至實驗場所時，窩鼠應至少適應30 min后再行實驗。試驗前將少量滅菌后無味的棉花放至窩鼠中，以沾染母鼠氣味，約15 min后，將母鼠與乳鼠分籠。操作時實驗人員應更換新手套，并用醫用酒精噴手。注射完后乳鼠可放置于鼠籠的另一角，并用事先放置的棉花與未注射的乳鼠分隔，避免混淆。全部乳鼠注射完畢后，取走棉花，取籠中墊料灑于乳鼠身上，單獨飼養至少30 min后，再將母鼠與乳鼠合籠，合籠前用酒精棉球在母鼠鼻子上擦拭，以降低母鼠嗅覺的靈敏度，合籠后需觀察一段時間，若出現母鼠吃仔的情況，則應立刻將母鼠與仔鼠分籠，較長時間后再按前述方法合籠。在注射不同窩的窩鼠時，也應更換新手套并用醫用酒精噴手。

以上為筆者在實驗過程中的經驗總結，僅供參考，望能提高外源病毒因子檢測的操作可行性與結果準確性。