慢性尿路感染大鼠模型的動態變化研究*

鐘志勇 馮學軒 嚴家榮 劉盛來 劉驥德 鄭玉連 唐小江

(廣東省醫學實驗動物中心，廣州 528248)

慢性尿路感染(Chronic urinary tract infection, CUTI)是臨床常見的泌尿系統感染性疾病，主要指細菌、真菌等微生物病原體在尿路中異常生長、繁殖、侵犯黏膜或組織，繼而引起以尿路刺激癥狀為主要臨床特征的泌尿系統常見病[1-3]。現代醫學對于CUTI的研究表明，腸道革蘭氏陰性菌中的大腸埃希菌為CUTI的常見致病菌，約占70%～90%[4-6]。患者感染后可出現腰膝酸軟、尿頻、尿急、尿痛、排尿淋漓不盡、下腹墜脹等癥狀[7]，此病發病率高，受累群眾廣[8]，嚴重影響患者的心理和生理健康。因此，研發有效的治療藥物顯得尤為迫切，但要進行藥物的研究和篩選，必須建立合適的實驗動物模型，這樣才能更好地“對癥下藥”。目前，針對CUTI的研究大多局限于造模—給藥—指標檢測這樣的研究模式當中，對于CUTI動物模型的動態變化并沒過多的研究，因此對于模型發病高峰，病程，病情的發展也并沒太多的了解，此舉極有可能造成在實驗過程中用藥時機不當，進而影響藥效的評價，得出假陰假陽的結果。

據此，本文擬通過膀胱內注入定量大腸埃希菌，建立慢性尿路感染大鼠模型，并在疾病發展過程中定期進行體溫、尿菌、尿白細胞、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、血常規等動態監測，并設左氧氟沙星陽性對照組，首次探討此類造模方法建立的CUTI模型的動態變化情況以及抗菌藥物干預后的疾病發展情況，為日后CUTI模型的完善及應用于藥物開發提供基礎的實驗資料及參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物和飼養環境：SPF級SD大鼠，30只，雌性，由廣東省醫學實驗動物中心提供，合格證號：44007200014887；動物飼養在廣東省醫學實驗動物中心SPF級動物房的IVC系統中，實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2013-0002。單籠飼養，飼養溫度與濕度：20～26 ℃，40%～70%，采用10 h∶14 h晝夜間斷照明。動物自由進食和飲水，所有飼料和飲用水均由廣東省醫學實驗動物中心提供。

1.1.2藥物及主要試劑：鹽酸左氧氟沙星片：批號A1401001、A1401002，哈藥集團制藥總廠，按100 mg∶20 mL的質量體積比配制成5 mg/mL的藥液；尿素氮(BUN)試劑盒：批號20140332，上海科華生物工程股份有限公司生產；肌酐(Cr)試劑盒：批號20140112，上海科華生物工程股份有限公司生產；大腸桿菌O111B4菌株：由廣東省中醫院微生物檢測室贈送。

1.1.3主要儀器:BS-3000A電子分析天平：精度0.1 g，上海友聲衡器有限公司；DHG-9245A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；LMQ.C立式滅菌器：山東新華醫療器械股份有限公司；RM2135輪轉切片機：德國LEICA公司；TS-12C生物組織全自動脫水機：湖北孝感醫用儀器有限公司；BM-VII生物組織包埋機及冷凍機：湖北孝感醫用儀器有限公司；CS-VI攤片烤片機：湖北孝感醫用儀器有限公司；RS-18生物組織全自動染色機：湖北孝感醫用儀器有限公司；BX43病理圖像分析系統：日本奧林巴斯。

1.2 方法

雌性SPF級SD大鼠，30只。檢疫合格后，隨機分為假手術組、模型對照組、鹽酸左氧氟沙星組，10只/組。實驗前大鼠禁食禁水12 h，術前大鼠經手按壓膀胱使排空膀胱內殘留尿液后，按0.2 mL/100 g體質量經腹腔注射3%戊巴比妥鈉進行麻醉，仰位固定大鼠，下腹部剃毛后，醫用酒精消毒，無菌操作下，在下腹膀胱位置，切開腹壁1～3 cm，暴露膀胱，手持鑷子固定膀胱，用1 mL滅菌注射器吸取大腸桿菌液(密度為107個/mL)，按0.5 mL/只的體積緩慢注入膀胱內，腹壁縫合、消毒，夾住尿道口兩側皮膚后放回籠內，繼續禁水飼養6 h。假手術組不注入大腸桿菌，其余操作一致。鹽酸左氧氟沙星組按2 mL/100 g體質量的劑量灌胃5 mg/mL鹽酸左氧氟沙星片藥液，假手術組和模型對照組給予等量純凈水，連續30 d。造模當天測量大鼠體溫，采集血液測定血常規、收集尿液測尿白細胞及尿細菌數。

1.3 檢測指標

1.3.1觀察：每天觀察動物的一般臨床情況，若有死亡動物應及時進行解剖，并觀察內臟各器官形態變化。

1.3.2體質量：實驗期間每周測量體質量1次。

1.3.3體溫： 實驗期間每周測量體溫1次。

1.3.4血常規、BUN、Cr的測定： 實驗期間每周經眼眶采EDTA抗凝血測量血常規1次，采促凝血，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取血清測定BUN及Cr含量。

1.3.5尿白細胞及尿細菌：實驗期間每周采用代謝籠收集4 h尿液測定大鼠尿白細胞、尿細菌1次，代謝籠使用完畢立刻消毒。

1.3.6腎臟和膀胱臟器感染菌計數：實驗結束當天(第30天)，在無菌條件下，各組大鼠均取右側腎臟及一半的膀胱組織，分別稱重后剪碎，右腎加5 mL無菌生理鹽水勻漿；一半膀胱加1 mL滅菌生理鹽水勻漿。吸取50 μL勻漿液于瓊脂平皿培養基上均勻鋪開，置37 ℃ 培養箱中培養24 h 后，進行菌落形成數(colony formation unit, CFU) 計數。每只動物的菌落數以每毫克濕組織所能培養出的CFU 計算。

1.3.7病理學檢測：各組大鼠取左側腎組織及另一半膀胱組織，4%中性甲醛固定后，常規石蠟切片，HE染色，進行病理組織學檢查，并按表1進行評分[10]。

表1 組織病理學評分表Table 1 Histopathological evaluation scale

1.4 統計方法

2 結果

2.1 體質量測量結果

與假手術組相比，模型對照組造模后第14、21天體質量明顯降低，有統計學差異(P<0.05)；與模型對照組相比，鹽酸左氧氟沙星組體質量無統計學差異(P>0.05),見圖1。

2.2 體溫測量結果

與假手術組相比，模型對照組造模后第14、21天體溫升高明顯，有統計學差異(P<0.05)；與模型對照組相比，鹽酸左氧氟沙星組體溫有所降低，但無統計學差異(P>0.05),見圖2。

圖1 實驗期間各組大鼠體質量變化情況注:與假手術組相比，△P<0.05，△△P<0.01Fig.1 The body weight of each group during the experiment periodNote: Compared with the Sham group, △P<0.05，△△P<0.01

圖2 實驗期間各組大鼠體溫變化情況注:與假手術組相比， △△P<0.01Fig.2 The body temperature of each group during the experiment periodNote: Compared with the Sham group, △△P<0.01

2.3 尿細菌數測定結果

造模前各組間尿細菌數無統計學差異(P>0.05)。造模后，與假手術組相比，模型對照組第7～28天各測定時間點尿細菌數明顯增加，有統計學差異(P<0.05)；與模型對照組相比，鹽酸左氧氟沙星組第7～28天各測定時間點，尿細菌數明顯減少，有統計學差異(P<0.05),見表2。

2.4 腎臟、膀胱感染菌結果

與假手術組相比，模型組膀胱染菌數和腎臟染菌數明顯增加，有統計學差異(P<0.05)；與模型對照組相比，鹽酸左氧氟沙星膀胱染菌數和腎臟染菌數均明顯減少，有統計學差異(P<0.05),見表3。

表2 各組大鼠尿細菌數變化情況♀)Table 2 Number of urine bacterial in each ♀)

注：采用重復測量方差分析方法進行統計分析。與假手術組相比，△△P<0.01；與模型對照組相比，**P<0.01

Note：Repeated measures anova was used for statistical analysis.Compared with the Sham group,△△P<0.01; Compared with the Model group,**P<0.01

表3 各組大鼠腎臟、膀胱感染菌結果♀)Table 3 Number of kidney and bladder bacterial in♀)

注：腎臟染菌數采用sin轉換后方差分析，膀胱染菌數采用秩和檢驗的統計方法進行分析。與假手術組相比，△△P<0.01；與模型對照組相比，**P<0.01

Note：Anova was used after sin transformation for kidney bacterial statistical analysis. Rank sum test was used for bladder bacterial statistical analysis。Compared with the Sham group,△△P<0.01; Compared with the Model group,**P<0.01

2.5 血清BUN值、血清Cr值：

各組動物在各測定時間點的血清BUN值、Cr值均未見有統計學意義(P>0.05)。

2.6 血常規

2.6.1白細胞數及分類：與假手術組相比，模型對照組第7、14、21天白細胞數升高有統計學差異(P<0.05)，在白細胞分類中，淋巴細胞數、嗜堿性粒細胞數、單核細胞數、中性粒細胞數、嗜酸性粒細胞數在各測定時間點上均未見統計學差異(P>0.05)；與模型對照組相比，鹽酸左氧氟沙星組第0、7、14天嗜酸性粒細胞數升高有統計學差異(P<0.05)，其余白細胞指標無統計學差異(P>0.05),表4～6。

表4 各組大鼠白細胞、淋巴細胞數♀)Table 4 The number of white blood cells and lymphocytes in each ♀)

注：采用重復測量方差分析方法進行統計分析。與假手術組相比，△P<0.05

Note：Repeated measures anova was used for statistical analysis. Compared with the Sham group,△P<0.05

表5 各組大鼠單核細胞、中性粒細胞數♀)Table 5 The number of monocytes and neutrophils in each ♀)

注：采用重復測量分析方法進行統計分析

Note：Repeated measures anova was used for statistical analysis

2.6.2紅細胞及血紅蛋白濃度：與假手術組相比，模型對照組第0、7、14、28天紅細胞數升高，第7、14天血紅蛋白濃度升高有統計學差異(P<0.05)；與模型對照組相比，鹽酸左氧氟沙星組紅細胞及血紅蛋白濃度在各測定時間點無統計學差異(P>0.05),表7。

2.6.3血小板數：各組動物在各測定時間點的血小板數均未見有統計學意義(P>0.05),表8。

表6 各組大鼠嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞數♀)Table 6 The number of eosinophil and basophil in each ♀)

注：采用重復測量方差分析方法進行統計分析。與模型對照組相比，*P<0.05,**P<0.01

Note：Repeated measures anova was used for statistical analysis. Compared with the Model group,*P<0.05,**P<0.01

表7 各組大鼠紅細胞數、血紅蛋白濃度♀)Table 7 Results of erythrocyte count and hemoglobin concentration in each ♀)

注：采用重復測量方差分析方法進行統計分析。與假手術組相比，△P<0.05,△△P<0.01

Note：Repeated measures anova was used for statistical analysis. Compared with the Sham group,△P<0.05,△△P<0.01

表8 各組大鼠血小板數♀)Table 8 The number of platelet in each ♀)

注：采用重復測量分析方法進行統計分析

Note：Repeated measures anova was used for statistical analysis

2.7 組織病理學檢測

2.7.1評分結果：與假手術組相比，模型對照組病理學評分升高有統計學差異(P<0.05)。與模型對照組相比，鹽酸左氧氟沙星組病理學評分下降有統計學差異(P<0.05),見表9。

2.7.2組織病理學觀察：假手術組膀胱及腎臟結構均無異常。模型組所有動物膀胱可見黏膜下層炎性細胞浸潤，20%的動物可見黏膜下層血管擴張充血；部分動物腎臟局部間質內可見炎性細胞聚集。鹽酸左氧氟沙星組只有20%的動物膀胱可見黏膜下層少量炎性細胞浸潤，其余動物膀胱組織結構均未見異常；有1只動物腎臟可見少量炎細胞浸潤，其余動物腎臟組織結構未見異常,見圖3、圖4。

表9 各組別病理學評分中各分值的動物數Table 9 The number of animals of eachpathological grade in different groups

注：采用卡方檢驗的分析方法進行統計分析。與假手術組相比，△△P<0.05；與模型對照組相比，**P<0.05

Note：Chi-square test was used for statistical analysis. Compared with the Sham group,△△P<0.05; Compared with the Model group,**P<0.05

圖3 慢性尿路感染大鼠膀胱病理學結果(×100)——200 μmFig.3 The bladder histopathological results of chronic urinary tract infected rats

圖4 慢性尿路感染大鼠腎臟病理學結果(×100)——200 μmFig.4 The kidney histopathological results of chronic urinary tract infected rats

3 討論

任何藥物的開發，都必須在人類疾病動物模型上確認有效，才能以人作為無危害的受試者。因此，在進行慢性尿路感染(CUTI)的藥物開發時，對CUTI動物模型的動態變化研究也應成為其研究的重點之一。立足于此，本文根據CUTI的發病特點[6, 9-11](女性發病率高、大腸桿菌為主要病原菌，上行感染為常見的感染類型)，采用大腸桿菌逆行感染法成功建立雌性大鼠的CUTI模型[10, 12]，并首次對疾病模型的發展情況進行動態監測。

在以往的造模方法中，大多采用逆行感染法進行造模，但對于保證大腸桿菌在尿路中的黏著時間缺乏足夠的重視，沒有為大腸桿菌提供良好的黏著條件。在本實驗中，我們采用擠壓膀胱排空尿液，注意造模前后的禁水以及采用夾閉尿道口的方法為大腸桿菌提供良好的尿路黏著環境，以利于成功建模。在實驗過程中發現，造模后在第14、21天的監測點，模型動物體溫上升最為明顯，尿液細菌數也在這兩個監測點達到最大值，與之對應的血液白細胞數在第7、14、21天這三個監測點與假手術組存在顯著差異。建模第30天結束實驗時發現，模型動物腎臟和膀胱菌數大幅度升高，病理檢查結果顯示模型動物均出現膀胱炎，黏膜充血，部分動物出現腎炎，且病理評分高分值的動物數顯著增多，具有明顯的尿路感染特征。根據感染部位的不同，CUTI可分為上尿路感染，主要指的是腎盂腎炎，以及下尿路感染，包括尿道炎和膀胱炎[1]。因此，從上述的動態監測結果及病理診斷結果可判斷，在本實驗的造模條件下，可建立具有明顯下尿路感染癥狀和具有一定的上尿路感染癥狀的動物模型，此模型的疾病嚴重程度屬于中等程度，且在這模型中，CUTI動物的發病最高峰主要集中在細菌接種后的第14～21天，這段時間炎癥發生明顯，疾病表現會最為突出，同時也最適合對藥物進行藥效學觀察，但是，藥物的干預則應在這段時間之前進行。此外，為證明此模型是否適合用于藥效學研究，本實驗同時設置了鹽酸左氧氟沙星干預組，實驗過程發現，給予抗生素干預，CUTI動物無論在感染菌數還是組織炎癥上，均有好轉趨勢。

在進行藥效研究時，用于初步藥效學觀察的動物疾病模型建模不宜過于嚴重，否則容易掩蓋藥效，從而錯誤地淘汰了具有潛在開發價值的藥物。在本實驗的造模條件下，建立的是中等程度的慢性尿路感染動物模型，可用于藥物的初步藥效學篩選，同時本實驗還提供了模型的動態變化檢測結果，為何時進行藥物干預、藥效觀察提供了實驗基礎上的參考。