用五種標準物質的穩定性評價實驗動物遺傳質量研究

王 洪 魏 杰 邢 進 鞏 薇 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

無論是藥物的研發還是藥品的質量控制都離不開動物實驗，動物實驗必須要使用標準化的實驗動物才能獲得重復性好，具參考性的實驗結果。而標準化的實驗動物必須通過全方位的質量控制來實現。遺傳質量控制是其中尤為重要的一環。遺傳質量控制的主要方法之一是生化標記檢測法。該方法是實驗動物遺傳質量控制的經典方法。選擇一些在品系間具有多態性的同工酶和異構蛋白作為生化標記，生化標記的差異體現的是編碼該生化標記的DNA序列的差異。不同品系具有各自獨特的生化標記基因。生化標記檢測法涵蓋14個生化標記位點，每個位點都需要相應的標準物質用于實驗動物遺傳質量評價的結果判定。標準物質的研發與應用，一方面可以節約檢驗時間，提高工作效率；另一方面可以有效減少實驗動物的使用量，符合動物倫理和3R原則[1-2]。

生化標記檢測法的14種標準物質主要應用于實驗動物的遺傳質量評價，同時也在實驗動物領域的能力驗證活動中廣泛應用。本研究主要對5個生化標記(蘋果酸酶-1、異檸檬酸脫氫酶-1、堿性磷酸酶-1、過氧化氫酶-2和肽酶-3)標準物質的穩定性展開研究。評價溫度和時間對5種標準物質的影響。以期獲得該標準物質的保存條件和運輸條件，為實驗動物遺傳質量評價使用標準物質的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

10只SPF級8周齡雄性C57BL/6小鼠和10只SPF級8周齡雌性BABL/c小鼠，均來源于國家嚙齒類實驗動物種子中心[SCXK(京) 2014—0013]。10只SPF級8周齡雌性CBA小鼠，來源于上海斯萊克有限公司[SCXK(滬) 2012—0002]。按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 樣品制備

采用安樂死處死動物，剖腹，取小鼠腎臟2只，加入預冷的蒸餾水，蒸餾水與腎臟的比例為2∶1(V/W)。用組織勻漿器勻漿，然后置4 ℃低溫高速離心機中，15 000 r/min，30 min。取上清，加保護劑，分裝，裝量70 mg/瓶，用凍干機，凍干。小鼠腎勻漿凍干樣品為紅色固體。加蓋，封口膜封口，封口袋包裝。采用隨機數字方式編號。貯藏條件為密封，冷藏[3-5]。

1.3 穩定性檢驗[6]

1.3.1分別將時間和溫度設為橫、縱坐標，設定-20 ℃，4℃，室溫和37 ℃ 4個溫度檢驗點，設定1、2、3、7、14、30、60、90 d為8個時間檢驗點，在每個坐標交點，隨機抽取1瓶進行檢驗。

1.3.2在取出日期，依據國家標準GB/T14927.1—2008對樣品進行檢測，觀測穩定性結果[6]。所有樣品均需加入70 μL蒸餾水還原。

1.3.3記錄不穩定結果出現的時間和溫度，本測定的觀測周期為90 d時長。

1.3.4匯總穩定性結果，填寫各自時間、溫度穩定性結果報告單。

1.3.5穩定性結果判定：如發現任何1瓶發生條帶模糊不可讀，則認為在該觀測點樣品的穩定性已經發生了變化，即在該時間溫度條件下該樣品不穩定。

2 結果

共制備堿性磷酸酶-1標準品60份。肽酶-3、過氧化氫酶-2、蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1標準品共178份。

蘋果酸酶-1樣本在37 ℃條件下穩定至第1天，在保存至第2天時，條帶模糊，無法辨認。在室溫條件下，該樣本可穩定保存至3 d。在4 ℃和-20 ℃可以穩定保存至90 d。異檸檬酸脫氫酶-1樣本在37 ℃條件下穩定至第1天，在保存至第2天時，條帶模糊，無法辨認。在室溫條件下，該樣本可穩定保存至3 d。在4 ℃和-20 ℃可以穩定保存至90 d。堿性磷酸酶-1樣本在37 ℃條件下穩定至第1天，在保存至第2天時，條帶模糊，無法辨認。在室溫條件下，該樣本可穩定保存至5 d。在4 ℃和-20 ℃可以穩定保存至90 d。過氧化氫酶-2樣本在37 ℃條件下穩定至第3天。在室溫條件下，該樣本可穩定保存至3 d。在4 ℃和-20 ℃可以穩定保存至90 d。肽酶-3樣本在37 ℃條件下穩定至第1天，在保存至第2天時，條帶模糊，無法辨認。在室溫條件下，該樣本可穩定保存至14 d。在4 ℃和-20 ℃可以穩定保存至90 d。詳見表1。

如圖1所示，在室溫條件下，蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1的標準物質放置1、2、3、7 d和14 d的電泳條帶，1、2和3 d的條帶清晰可見。7 d和14 d的電泳條帶模糊，無法辨認。如圖2所示，在4 ℃和-20 ℃條件下，堿性磷酸酶-1的標準物質放置30 d、60 d和90 d的電泳條帶，清晰可見。如圖3所示，在4 ℃和-20 ℃條件下，過氧化氫酶-2的標準物質放置30 d、60 d和90 d的電泳條帶，清晰可見。如圖4所示，在4 ℃和-20 ℃條件下，肽酶-3的標準物質放置30 d、60 d和90 d的電泳條帶，清晰可見。

表1 五種標準物質的穩定性檢驗結果Table 1 Stability results of 5 standard substances

圖1 蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1 在室溫條件下的電泳結果注： 1∶1d； 2∶2d； 3∶3d； 4：Marker1(b,a)；5：Marker2(b,b)； 6：Marker3(a,a)；7:7d； 8：14d Fig.1 Electrophoresis results of Mod1 andIdh1 in room temperatureNote: 1:1d； 2:2d； 3:3d； 4：Marker1(b,a)；5：Marker2(b,b)；6：Marker3(a,a)；7:7d； 8:14d

圖2 堿性磷酸酶-1在4 ℃(1-3)和-20 ℃(7-9)存放后的電泳結果注：1：30d； 2：60d； 3：90d；4：Marker1(a)；5：Marker2(b)； 6：Marker3(b)； 7：30d； 8：60d； 9：90dFig.2 Electrophoresis results of Akp1 in4 ℃(1-3)and -20 ℃(7-9)Note: 1：30d； 2：60d； 3：90d； 4：Marker1(a)；5：Marker2(b)； 6：Marker3(b)；7：30d； 8：60d；9：90d

圖4 肽酶-3在4 ℃(1-3)和-20 ℃(7-9)存放后的電泳結果注：1：30d； 2：60d； 3：90d；4：Marker1(a)；5：Marker2(a)； 6：Marker3(b)； 7：30d； 8：60d； 9：90dFig.4 Electrophoresis results of Pep3 in 4 ℃(1-3)and -20 ℃(7-9)Note: 1：30d； 2：60d； 3：90d；4：Marker1(a)；5：Marker2(a)； 6：Marker3(b)；7：30d； 8：60d；9：90d

3 討論

3.1 貯存條件和運輸條件

溫度升高將導致蛋白質的生物學活性喪失，酶的生物學功能失效。生化標記方法是通過生物化學方法染色來識別不同品系動物在各生化標記位點的差異。一旦酶的生物學功能喪失，將無法通過酶類的不同基因型將不同品系的動物區分開來。標準物質一旦喪失穩定性，將無法作為實驗動物遺傳質量的評判標準。因此，溫度是決定標準物質穩定性的重要因素之一。本研究選擇了4個溫度點和8個時間點。選擇室溫，而不是設定為25 ℃，是希望溫度條件盡量接近真實情況。本研究工作的實施時間是在北京5—7月。室溫在30 ℃左右。以肽酶-3為例，本研究中肽酶-3在室溫條件下可以穩定保存14 d。而有研究發現，在北京1—2月，室溫在20 ℃左右的情況下，肽酶-3標準物質可以在室溫穩定存放28 d。因此，室溫狀態下的實際溫度，因地域而異，因季節而異。標準物質不應在室溫狀態下長期存放。在4 ℃和-20 ℃條件下，5種標準物質均可以穩定保存至90 d。可見，4 ℃和-20 ℃是適于標準物質長期保存的溫度。而37 ℃對于標準物質來說，是極不穩定的溫度。除了過氧化氫酶-2可以穩定3 d以外，其它4種標準物質只能穩定1 d。因此，在標準物質制備完成到使用之前的貯存條件應嚴格控制在4 ℃以下。如果涉及到標準物質的運輸，應全程控制溫度。因此，無論是標準物質的貯存，還是標準物質的運輸都必須嚴格控制溫度。

3.2 不同位點的穩定性存在差異

國家標準中的14個生化標記的標準物質，對溫度的敏感程度各不相同，不同位點的穩定性存在差異。過氧化氫酶-2比其他位點在37 ℃穩定的時間更久(3 d)。不同位點需要分別做穩定性檢驗。保證標準物質的穩定性，同時也是遺傳質量評價工作順利開展的保障[7]。

3.3 標準物質在能力驗證活動中的應用

標準物質的穩定性對于能力驗證活動的開展也至關重要。能力驗證可通過實驗室間比對，確定實驗室的檢測或校準能力，能力驗證樣品的一致性對能力驗證的整個過程至關重要。在實施能力驗證計劃時，組織方應確保能力驗證中出現的不滿意結果不歸咎于樣品之間或樣品本身的變異性。因此，對于能力驗證樣品的檢測特性量，須進行均勻性檢驗和(或)穩定性檢驗。國家實驗動物遺傳質量檢測中心負責全國實驗動物質量檢測機構遺傳生化標記位點堿性磷酸酶-1等14個項目的能力驗證評價計劃的實施。我們通過評價堿性磷酸酶-1、過氧化氫酶-2、肽酶-3、蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1這5種標準物質的穩定性，以確保發出的能力驗證樣品完全符合要求。在能力驗證提供者認可評審以及監督評審中，樣本的穩定性檢驗都是重要的考察項[3]。

通過本研究發現標準物質在室溫波動較大和37 ℃極不穩定，在4 ℃和-20 ℃，可以長期穩定。說明標準物質是一類對溫度較為敏感的物質。有必要嚴格控制標準物質的保存條件和運輸條件。依據本研究獲得的穩定性檢驗的數據可以為標準物質的應用提供技術保障。