circRNA研究進展*

陸彩霞 代解杰

（中國醫學科學院/北京協和醫學院，醫學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室，昆明 650118）

環狀 RNA（circRNA）是一類不同于線性 RNA的特殊的非編碼RNA分子，來源于基因的外顯子或內含子區域，是近年來在RNA分子生物學領域冉冉升起的一顆新星。circRNA以共價鍵形成封閉環狀結構，不易被核酸外切酶降解，比線性RNA更穩定。20世紀70年代 H.L.Sanger等[1]首次在植物類病毒中發現了 circRNA。1979年 Hsu和 Coca-Prados在電子顯微鏡下觀察到環狀RNA也存在于真核細胞細胞質中。1993年在小鼠睪丸中發現由性別決定基因Sry轉錄而來的circRNA。2006年又在果蠅中發現來自于盲肌的未知環狀 RNA。2012年，Salzman等利用RNA-Seq方法研究癌癥相關的染色體重排或基因融合，首次報道了環狀RNA不但在癌細胞樣本中存在，而且在人正常細胞系、小鼠腦組織中也大量存在，在細胞中的總量約占線性 RNA的1%，部分環狀RNA的豐度超過了對應等位基因位點的線性RNA[2-3]。最新的研究表明，circRNA在疾病發生和發展階段發揮重要作用，可以作為潛在的分子生物學標記。circRNA一開始被認為是RNA異常剪接的產物[4]，加上表達豐度一直很低，又受限于當時的檢測技術，并未引起研究者的注意。近年來隨著高通量測序技術和生物信息學的快速發展，發現了大量的 circRNA分子，環狀 RNA開始正式進入科研視界，開啟了circRNA快速研究發展的黃金時代。

1 circRNA的分子特征

circRNA與線性RNA結構不同，沒有5'-3'的極性，也沒有 polyA尾巴，是封閉環狀結構，因此比線性RNA穩定，不容易被 RNA核酸外切酶或者RNaseR降解。circRNA表達豐度差異大，在有些組織中，比對應線性 RNA多10倍以上[5]。circRNA大部分由外顯子組成，主要存在于細胞質中，由內含子組成的circRNAs則存在于細胞核中，具有組織和時空特異性。比如hsa_circRNA_2149只在CD19+白細胞而不是 CD34+白細胞，中性粒細胞或者HEK293中表達[6]。一些線蟲circRNA在卵母細胞中表達，在1-或者2-細胞胚胎中不表達。絕大部分的circRNA是內源非編碼RNAs，只有一小部分是外源的 circRNA，如 HDV，含有核糖體進入位點（IRESs）的人工circRNA[7]。不同物種間的circRNA大部分是進化保守的，也有部分是進化不保守的[5]。Gao等[8]對環形RNA外顯子結構和可變剪接事件進行了研究，發現可變剪接事件在環形RNA內部普遍存在，在定位上具有明顯的核內傾向，同時表現出組織和發育階段特異的表達模式。

2 circRNA的形成機制

circRNA的產生方式不同于線性RNA的標準剪切模式，是通過反向剪切形成。現有的 circRNA形成機制有外顯子跳躍、直接反向剪切、環狀內含子RNA（ciRNAs）形成模式、依賴于 RBPs環化模式、類似于可變剪切的可變環化模式[9]。

外顯子環狀RNA（circular exonic RNA）主要存在于細胞質中，由 pre-mRNA的索尾插接產生，即由下游外顯子的剪接供體連接到上游外顯子的剪接受體上的[10]。外顯子環化有2種模式[5]：模式1定義為外顯子跳躍，pre-mRNA的下游外顯子SD的3‘端連接到上游外顯子的SA的5'端，拉近了原本非相鄰的外顯子，形成套索，再切除內含子，形成由2外顯子組成的 circRNA。模式2定義為內含子配對驅動環化，pre-mRNA中的2個內含子通過堿基互補配對形成套索，再切除內含子，形成circRNA。William等[5]發現這兩種環化模型有一個共同特點，二者均包含互補性的ALU重復序列的長側翼內含子。當兩個以上的外顯子在環化時，它們之間的內含子可能滯留其中，最終形成既有外顯子又有內含子的EIciRNA[11]。 ecircRNA和 EIciRNA由 3′-5′磷脂鍵連接環化。

內含子環狀RNA（ciRNA）主要存在細胞核中，研究發現，部分內含子在剪接作用中形成套索結構，但是很快被脫分支降解[12]。而Zhang等[13]在Hela細胞和人胚胎干細胞中發現一些含關鍵核酸序列的內含子能躲避分支酶降解，形成內含子來源的環狀RNA.

3 circRNA的分類

3.1 ecircRNA（Exonic circRNA）

由外顯子構成，轉錄本的反向剪切形成，主要存在于細胞質中[14]。

3.2 ciRNAs

由內含子形成，剪切于pre-mRNA，ciRNAs的形成依賴于一個在5'端含有7個富集GU的基序和分支點含有11個富集C的基序，在剪接作用后不被脫分支酶降解從而加工形成ciRNAs，主要存在于細胞核中[13]。

3.3 EIciRNA

內含子保留的轉錄本反向剪切，當兩個以上的外顯子在環化時，它們之間的內含子可能滯留其中，最終形成既有外顯子又有內含子的 EIcirRNA，主要存在于細胞核中[11]。

3.4 tricRNA（tRNA in tronic circRNA）

由pre-tRNA剪切后形成的tricRNA[15]。

4 circRNA的功能

4.1 m icroRNA海綿

目前已發現7種circRNA具有microRNA海綿作用：ciRS-7/CDR1as、Sry circRNA（circ-Sry）、 circ-ITCH、 circ-Foxo、 circRNA HRCR、circHIPK353 和hsa_circ_00156954[16]

CDR1as是小腦變性相關蛋白1反義轉錄物，是一種ecircRNA，其長度約為1.5 kb，定位于細胞質中，主要在人和小鼠的腦中表達。CDR1as含有超過70個能和m iR-7結合的位點，能吸附miR-7降低其活性，因此，CDR1as被稱為 miR-7的circRNA海綿[17]

Sry是性別決定基因，高表達于成年小鼠睪丸內[18]，由Sry基因轉錄而來的 circRNA含有16個miR-138結合的保守位點，并作為miR-138的海綿發揮作用[17]。雖然這兩個circRNA都含有與之對應的miRNA大量的結合位點是比較特殊的，但越來越多的研究表明circRNA在真核生物中作為miRNA海綿的功能是一個普遍的現象[16]。

4.2 調控母本基因表達

由于circRNA與其相同來源的線性miRNA的序列高度相似，可以通過cis或trans調控其母基因的表達。ciRNAs定位于細胞核中，通過與Pol II相互作用活化其母基因的轉錄[13]。EIcirRNA通過互補序列與U1snRNP和PolII結合，與U1 snRNP形成復合體，增強其母基因的轉錄[11]。

4.3 與RNA結合蛋白相互作用

目前研究發現有多種RNA結合（RNA-binding protein，RBP）可與 circRNA結合形成 RNA-蛋白質復 合 體 （RNA-protein comp lex，RPC），調 控circRNA的形成。盲肌（muscleblind，MBL）就是一種 RBP，可結合其親本基因第2外顯子，促進其環化形成circMbl；同時，circMbl與 MBL相互作用，平衡circMbl和mblmRNA的生成[19]，外顯子來源的circRNA（ecircRNA）可以穩定地與細胞內某些蛋白質分子特異性結合，作為骨架再通過互補序列與RNA或DNA結合。如ecircRNA可以與AGO蛋白和RNA聚合酶II相互作用進而發揮 miRNA海綿參與調控轉錄的作用[20]。

4.4 circRNA編碼蛋白

盡管circRNA被定義為非編碼 RNA，但有研究報道真核核糖體可以啟動含有核糖體進入位點（IRES）的 circRNA進行翻譯。1995年 Chen和Sarnow[21]發現合成含IRES的circRNA可以招募核糖體啟動翻譯機制，而不含 IRES的circRNA則不能。HDV是目前發現的一個環狀RNA分子，它可以編碼病毒相關蛋白質，與肝炎發生有關[7]。Chen等[22]對有潛在編碼蛋白質的circRNA進行了IRES和開放閱讀框（ORF）的注釋，并用質譜儀驗證了蛋白的表達，建立了首個匯總可編碼蛋白的circRNA數據庫。

5 研究circRNA常用的數據庫

5.1 circBase

是一個通過收集和整合已經發布的circRNA數據構建的數據庫。目前該數據庫收集包括以下6個物種的 circRNA信息：人（hg19）、小鼠（mm9）、秀麗線蟲（ce6）、黑腹果蠅（dm3）、矛尾魚（latCha1）、腔棘魚（latCha1）[23]。 網址：http：//www.circbase.org/

5.2 circRNABase

該數據庫提供了108個高通量實驗數據CLIPSeq（或稱為 HITS-CLIP，PAR-CLIP， iCLIP， CLASH）和mRNA降解組測序數據支持的m icroRNA靶標數據庫，通過整合已發表的 circRNA數據，構建m iRNA與circRNA以及circRNA與RNA結合蛋白（RBP）的互作網絡，構建了最全面的靶標預測軟件的交集和調控關系，但查閱不了circRNA的基因組信 息[24]。 網 址：http：//starbase.sysu.edu.cn/m irCircRNA.php。

5.3 Circ2Traits

是一個收集與人類疾病或性狀潛在關聯的circRNA數據庫。該數據庫通過預測miRNAs和人類的蛋白質編碼基因、長鏈非編碼基因及環狀RNA間的相互作用關系，構建了相互作用網絡，并對m iRNAs-circRNA相互作用中的蛋白編碼基因進行了GO富集分析，此外，將與疾病相關的 SNPs位點定位到circRNA基因座上，并鑒定了環狀RNAs上的 Ago相互作用位點[25]。網址：http：//gyanxetbeta.com/circdb/。

5.4 circNet

來源于464個RNA-seq測序數據，并進一步聯合m icroRNA等信息進行了整合分析，并對新circRNA預測及基因組注釋，并計算已知的及新預測的circRNA表達情況，構建circRNA-miRNA-genet調控網絡。數據庫中含有circRNA分子序列、circRNA與 m iRNA及靶基因的調控網絡、circRNA分子的表達譜及circRNA分子的基因組注釋等信息[26]。 網址：http：//circnet.mbc.nctu.edu.tw/。

5.5 CircInteractom e

該數據庫預測了已知的109個RNA結合蛋白數據集與circbase中的circRNA的結合位點，并利用Targetscan軟件預測了m iRNAs與circRNA的潛在結合位點。同時可以進行circRNA分子檢索，circRNA的PCR引物設計，circRNA的siRNA干擾序列 設 計[27]。 網 址：http：//circinteractome.nia.nih.gov/。

5.6 circRNADb

是首個匯總可編碼蛋白的circRNA數據庫。收錄了32 914條人類外顯子circRNA記錄，包括其基因組信息，外顯子剪切，所對應基因組序列，對具有蛋白編碼潛能的 circRNA進行了 IRES和 ORF注釋[22]。 網址：http：//reprod.njmu.edu.cn/circrnadb

其他的數據庫還有deepBase v2.0平臺（網址：http：//deepbase.sysu.edu.cn/）、 TSCD 數 據 庫（http：//gb.whu.edu.cn/TSCD）、CIRCpedia數據庫（http：//www.picb.ac.cn/rnom ics/circpedia/）等，數據庫的豐富方便了研究者對circRNA功能的進一步研究。

6 circRNA與神經系統疾病

目前有許多研究表明circRNA在疾病的發生發展過程中起到了極其重要的作用，有在未來成為疾病新的檢測標志物的潛力。已有研究表明circRNA與腫瘤[28]、動脈粥樣硬化[29]、糖尿病[30]、神經系統疾病等多種疾病相關。也有大量研究表明circRNA在哺乳動物腦中高表達[31-33]，尤其集中于突觸神經小體中[34]，中腦，大腦的新皮質區、海馬區、胚胎的新皮質區都存在不同種類的環狀RNA，一般來說，神經元越多的部位，環狀 RNA的含量也越多[35]。Zhang等[36]研究提示環形RNA在生理過程中同樣發揮重要功能，如在神經分化過程中，大量環形RNA分子表達水平升高，提示環形RNA有可能在此過程中發揮作用。

小腦退化相關蛋白1/2（CDR1/2）是浦肯野氏細胞抗原，CDR1as是 CDR1的環狀天然反義轉錄物，在神經組織中高表達，Ghosal等[25]預測其可能與帕金森有關，因為神經元中m iR-7高表達，m iR-7可下調α-突觸核蛋白（α-synuclein）的表達，導致多巴胺生成細胞的損害，導致帕金森病。luKiw檢測到ciRS-7表達水平在散發型AD病人中顯著性降低，miR-7可以直接調節泛素化蛋白連接酶（UBE2A），UBE2A是一種有自體吞噬作用的噬菌蛋白，可以清除AD的淀粉酶和中樞神經系統的炎癥性退化[37]。Westholm等研究發現，在果蠅衰老過程中circRNA的水平相對于其線性miRNA持續增加，可以作為果蠅衰老的分子生物學標記[38]。

朊病毒病（prion disease）是人類和動物致死性中樞神經系統退行性疾病，Yamamura[39]報道在HEK293細胞中穩定高表達的細胞型朊蛋白（cellular prion protein，PrPC）可促進 CDR1as的表達，說明 PrPC可能參與了 CDR1as的調控，提示CDR1as在朊病毒病中可能發生作用。

7 展望

環形RNA是一類通過反向剪接，即下游剪接位點反向與上游剪接位點連接所形成的閉合環狀RNA分子，是非編碼RNA家族里一顆冉冉升起的新星，盡管大多數的環形RNA功能未知，但已有的研究顯示其在基因表達調控中發揮重要功能。circRNA的這種特性預示著它在未來可能成為一種新型的生物標志物，為疾病治療提供新的潛在的治療靶點。雖然circRNAs是目前研究的焦點，但該領域仍處于起步階段，還需要進一步深入研究和探索circRNAs分子形成、降解機制及生物功能，其參與疾病發生的詳細機制，轉錄組的世界可能比之前人們認為的更加復雜。隨著目前研究工具的不斷完善，相信在不久的將來，科研工作者們將揭開circRNA的面紗，在后基因組時代開啟一扇基因及疾病研究的大門。