電化學發光法檢測胃泌素釋放肽前體的性能評價及臨床應用評估

沈雋霏， 吳文浩， 周佳燁， 王蓓麗， 郭 瑋， 潘柏申

（復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032）

全國腫瘤登記中心最新的數據顯示，2012年全國惡性腫瘤發病率居第1位的是肺癌，每年新發病例約70.5萬。全國惡性腫瘤死亡率居第1位的也是肺癌，每年死亡病例約56.9萬[1]，其中小細胞肺癌（small-cell lung cancer，SCLC）約占新發肺癌病例的20%，雖然發病率遠不及非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC），但是SCLC惡性程度更高，侵襲性更強，易早期發生遠處轉移，預后極差[2]。因此，早期診斷SCLC是提高治療效果和改善預后的關鍵。傳統的影像學檢查難以發現早期SCLC微小的散在病灶，而組織活檢局限性更大，因此血清腫瘤標志物的檢測有著更大的優勢，如無創、操作方便、成本低廉等。一直以來，輔助診斷SCLC的主要腫瘤標志物為神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE），但NSE的特異性不佳且易受溶血干擾，因此近年來胃泌素釋放肽前體（pro-gastrin-releasing peptide，ProGRP）作為一種輔助診斷SCLC的新腫瘤標志物受到了廣泛關注[3-5]。我們對電化學發光法檢測ProGRP的性能進行了評價并初步評估其臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2014年1—12月復旦大學附屬中山醫院確診的SCLC患者48例，其中男45例、女3例，年齡38～77歲，所有患者均通過病理活檢或細胞學檢查[4-5]明確診斷；NSCLC患者79例，其中男47例、女32例，年齡33～81歲；肺部良性疾病患者40例，其中男17例、女23例，年齡24～84歲，包括社區獲得性肺炎、肺部血管瘤、間質性肺炎、肺部錯構瘤等；其他腫瘤患者60例，其中男34例、女26例，年齡40～84歲，包括食管癌、乳腺癌、肝細胞癌、胃癌、胰腺癌、結直腸癌等常見惡性腫瘤；自身免疫性疾病患者20例，其中男6例、女14例，年齡21～82歲，包括類風濕性關節炎、系統性血管炎等。以上所有對象均排除合并腎臟疾病。另選取復旦大學附屬中山醫院同期體格檢查和相關實驗室檢查均無異常的表觀健康者120名作為正常對照組，其中男60名、女60名，年齡22～74歲。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采用BD促凝分離膠真空采血管（美國BD公司）采集所有對象的空腹靜脈血樣本。樣本采集后2 h內196×g離心10 min，分離血清后置-80 ℃保存，樣本復融后需在2 h內完成檢測。

1.2.2 檢測方法 分別采用電化學發光法、化學發光微粒子免疫法和酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測ProGRP，試劑盒分別由瑞士Roche公司、美國Abbott公司和CanAg診斷產品（北京）有限公司提供。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、NSE和細胞角蛋白19片段（cytokeratin 19-fragment，CYFRA21-1）試劑盒（電化學發光法）均由瑞士Roche公司提供。檢測儀器分別為 cobas e601全自動免疫分析儀（瑞士羅氏公司）、ARCHITECT i2000sr全自動免疫發光分析儀（美國雅培公司）和ST-360酶標儀（上?？迫A公司）。

1.2.3 精密度評價 以高、低2個水平的混合血清作為待測樣本，分別連續檢測20次，計算均值及變異系數（coefficient of variation，CV），以此作為批內精密度。將高、低2個水平的混合血清分裝后于-20 ℃保存，連續檢測20 d，計算均值及CV，以此作為批間精密度。

1.2.4 回收試驗 重復測定混合血清10次，取均值，以此作為基礎水平，在該基礎血清中分別按1∶1的比例加入高值（261.0 pg/mL）和低值（15.8 pg/mL）定值標準品作為回收樣本，每份回收樣本重復檢測3次，取均值并與理論值進行比較，計算回收率。

1.2.5 線性范圍驗證 參考美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP6-A2文件[6]，將系列稀釋后的5個水平的樣本按低值到高值和高值到低值分別檢測2次，計算均值后分別使用一次方程、二次方程和三次方程進行擬合，以評估是否呈線性。

1.2.6 參考區間驗證 參考CLSI EP28-A3c文件[7]，采用20名表觀健康者樣本驗證試劑盒給定參考區間的適用性。若20名表觀健康者的ProGRP檢測結果高于給定參考區間的人數≤2名，認定該參考區間適用；若＞2名則需要重新驗證或自行建立參考區間。

1.2.7 方法學比較 采用電化學發光法、化學發光微粒子免疫法和ELISA同時檢測40份血清樣本，剔除超過檢測上限需要稀釋的結果，通過Pearson相關分析和Bland-Altman偏差分析比較不同方法檢測結果的一致性，以x ±1.96s作為一致性界限。

1.2.8 臨床應用評價 比較SCLC組、NSCLC組、各疾病對照組及正常對照組ProGRP結果的差異。以臨床病理結果或細胞學診斷結果為金標準，評估ProGRP單項或聯合其他腫瘤標志物（CEA、NSE、CYFRA21-1）診斷SCLC的性能，比較不同檢測方法的診斷效能。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0和Medcalc 12.7軟件進行統計分析。數據均呈非正態分布，以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間差異比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估ProGRP單項或聯合其他腫瘤標志物診斷SCLC的性能及不同檢測方法的診斷效能。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電化學發光法檢測ProGRP的方法學評價

2.1.1 精密度 電化學發光法檢測高、低2個水平ProGRP的批內精密度分別為0.8%和1.2%，批間精密度分別為0.9%和2.2%。見表1。

2.1.2 回收試驗 基礎血清ProGRP水平為226.2 pg/mL，分別與ProGRP高值、低值定值標準品1∶1混合后重新測定，回收率分別為99.86%和98.32%。見表2。

表1 電化學發光法檢測ProGRP的精密度結果

表2 電化學發光法檢測ProGRP的回收試驗結果

2.1.3 線性范圍驗證 一次多項式擬合方程為Y=0.995X+16.35，r2=1.0；二次多項式系數a的P值為0.731；三次多項式系數a的P值為0.669，b的P值為0.579。結果顯示二次、三次多項式系數與“0”差異無統計學意義，證明電化學發光法檢測ProGRP在33.13～4 796.00 pg/mL范圍內線性良好。

2.1.4 參考區間驗證 20名表觀健康者ProGRP檢測結果均在試劑盒聲明的參考區間內（0～69 .2 pg/mL），參考區間驗證通過。

2.1.5 方法學比較 Pearson相關分析顯示電化學發光法、化學發光微粒子免疫法和ELISA檢測ProGRP的結果相關性良好（電化學發光法與化學發光微粒子免疫法 r=0.988，P＜0.001；電化學發光法與ELISA r=1.000，P＜0.001；化學發光微粒子免疫法與ELISA r=0.989，P＜0.001）。Bland-Altman偏差分析顯示電化學發光法、化學發光微粒子免疫法和ELISA ProGRP結果在低值區域一致性良好，但隨著檢測結果的增加，偏差逐漸增大，當ProGRP＞500 pg/mL時出現趨勢性偏差，見圖1。

圖1 電化學發光法、化學發光微粒子免疫法和ELISA檢測ProGRP的Bland-Altman偏差分析

2.2 ProGRP的臨床應用評估

2.2.1 各組間ProGRP水平的比較 SCLC組、NSCLC組、肺部良性疾病組、其他腫瘤組、自身免疫性疾病組和正常對照組ProGRP水平分別為785.8（72.2～2 842.8）、43.1（31.2～50.0）、46.5（32.3～54.9）、32.5（17.1～48.6）、27.8（20.7～33.5）和30.8（17.3～42.5）pg/mL。SCLC組ProGRP水平明顯高于其他各組（P＜0.05），而其他各組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.2.2 ProGRP診斷SCLC的性能 ProGRP診斷SCLC的ROC曲線的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.963[95%可信區間（confidence interval，CI）0.868～0.931]，最佳臨界值為66.65 pg/mL，敏感性為79.2%，特異性為95.3%，陽性預期值為71.68%（95%CI 57.64～ 83.20），陰性預期值為96.83%（95%CI 94.24～98.47）。見圖2。

圖2 ProGRP診斷SCLC的ROC曲線

2.2.3 ProGRP聯合CEA、NSE、CYFRA21-1診斷SCLC的性能 為進一步研究ProGRP聯合CEA、NSE、CYFRA21-1診斷SCLC的性能，以診斷結果為因變量，ProGRP、NSE、CEA、CYFRA21-1為自變量，使用二元Logistic回歸分析分別擬合ProGRP聯合NSE（ProGRP+NSE）的方程、4項指標聯合（ProGRP + NSE+ CEA+ CYFRA21-1）的方程來預測二分位結果，并將2次擬合后的預測值與ProGRP和NSE一同繪制ROC曲線。結果顯示，ProGRP+NSE診斷SCLC的AUC為0.957、敏感性為83.3%、特異性為96.2%、陽性預期值為81.6%、陰性預期值為96.6%，診斷性能明顯優于單項檢測（P＜0.05）；與4項指標聯合檢測的診斷性能比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3、圖3。

2.2.4 電化學發光法、化學發光微粒子免疫法和ELISA檢測ProGRP診斷SCLC的ROC曲線比較 ROC曲線分析顯示，電化學發光法、化學發光微粒子免疫法和ELISA檢測ProGRP診斷SCLC的AUC（95%CI）分別為0.880（0.830～0.919）、0.892（0.844～0.929）、0.908（0.863～0.943），各方法間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

表3 ProGRP聯合CEA、NSE、CYFRA21-1診斷SCLC的性能評估

圖3 ProGRP聯合CEA、NSE、CYFRA21-1診斷SCLC的ROC曲線

3 討論

胃泌素釋放肽（gastrin-releasing peptide，GRP）是一種重要的調節分子，與人體許多生理功能、病理狀態有關。GRP是一種胃腸激素，最初由MCDONALD等[8]從豬胃黏膜中分離，廣泛分布于哺乳動物的神經系統、胃腸道和呼吸道[9]。有研究顯示GRP在SCLC患者中呈高表達，且對腫瘤的生長和轉移有較大的意義[10-11]。然而，由于GRP的半衰期極短（約2 min），因此難以準確完成臨床檢測。相比之下，GRP的前體結構——ProGRP更為穩定，其3種不同分子亞型的共同C端序列ProGRP（31～98）可作為輔助診斷SCLC的可靠腫瘤標志物[12]。

圖4 電化學發光法、化學發光微粒子免疫法和ELISA檢測ProGRP診斷SCLC的ROC曲線

本研究結果顯示電化學發光法檢測ProGRP的精密度、正確度、線性范圍、參考區間等各項性能指標均符合檢測要求。Pearson相關分析顯示電化學發光法、化學發光微粒子免疫法和ELISA檢測ProGRP的相關性良好，Bland-Altman偏差分析顯示電化學發光法、化學發光微粒子免疫法和ELISA檢測結果的偏差總體在合理范圍內，3種方法在低值部分具有良好可比性，但偏差隨檢測結果的增加而增大，ProGRP＞500 pg/mL時可比性較差。

本研究結果顯示，SCLC組ProGRP水平明顯高于其他各組（P＜0.05），與文獻報道[13]基本一致；而NSCLC組、肺部良性疾病組、其他腫瘤組和正常對照組ProGRP水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。ProGRP診斷SCLC的敏感性為79.2%、特異性為95.3%、陽性預期值為71.68%、陰性預期值為96.83%，稍優于NSE。NSE在檢測時易受溶血干擾，而ProGRP幾乎不受溶血影響，但患者腎功能不全會導致ProGRP水平升高，從而影響結果判斷[14]，因此ProGRP與NSE在輔助診斷SCLC時能互補。ProGRP與NSE聯合檢測診斷SCLC的敏感性為83.3%、特異性為96.2%、陽性預期值為81.6%、陰性預期值為96.6%，診斷性能明顯優于單項檢測，且與4項指標聯合檢測的診斷性能無差異。

電化學發光法、化學發光微粒子免疫法和ELISA檢測ProGRP診斷SCLC時的AUC分別為0.880、0.892和0.908，三者之間差異無統計學意義（P＞0.05），說明3種方法的診斷效能基本相同，但電化學發光法和化學發光微粒子免疫法的檢測范圍相比ELISA更寬，檢測時間更短，具有更大的臨床應用價值。

綜上所述，ProGRP是輔助診斷SCLC的可靠指標，具有很好的敏感性及特異性，有助于肺癌的組織學分型，還能與NSE聯合檢測，有利于早期診斷SCLC，改善患者的預后，具有良好的臨床應用前景。此外，有文獻報道ProGRP對SCLC的療效監測、復發評估以及預后評估均具有一定的價值[15]，有關這幾方面的情況將在今后的研究中進一步探討。

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