流式細(xì)胞術(shù)用于白血病外周血細(xì)胞檢測(cè)對(duì)急性白血病復(fù)發(fā)判斷的意義

葛麗衛(wèi)， 王笑顏

（1.解放軍第九八醫(yī)院，浙江 湖州 313000；2.湖州市中心醫(yī)院，浙江 湖州 313000）

急性白血病（acute leukemia，AL）是典型的非實(shí)體腫瘤，隨著工業(yè)污染的加劇和社會(huì)環(huán)境的改變，AL的發(fā)生率及死亡率逐年增加，嚴(yán)重地影響了患者及其家庭的生活質(zhì)量。隨著AL治療方案的不斷改進(jìn)，AL的治療水平不斷提高，初治AL患者有了較高的緩解率，但仍存在復(fù)發(fā)的可能[1]。目前臨床認(rèn)為引起AL復(fù)發(fā)的主要因素是患者在完成治療后體內(nèi)仍殘留一定的腫瘤細(xì)胞即微小殘留病變（microresidual disease，MRD），這些腫瘤細(xì)胞仍能繼續(xù)增殖，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)[2]。一般而言，AL細(xì)胞屬于表面抗原表型，具有異常光散射的特點(diǎn)，因此能夠通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）、單克隆抗體來(lái)檢測(cè)細(xì)胞表面不同抗原的熒光信號(hào)進(jìn)行識(shí)別。我們就FCM檢測(cè)外周血細(xì)胞檢測(cè)對(duì)AL復(fù)發(fā)判斷的意義進(jìn)行了分析。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年1—12月解放軍第九八醫(yī)院收治的142例AL患者，其中男76例、女66例，年齡22～68歲。排除急性早幼粒細(xì)胞白血病患者，分型包括急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）88例和急性淋巴白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）54例，診斷符合法美英（French-American-British，F(xiàn)AB）診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 方法

采用FCM對(duì)患者外周血標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。采集患者空腹靜脈血3 mL，用乙二胺四乙酸二鉀抗凝，采用藻紅蛋白、多甲藻葉綠素蛋白、異硫氰酸熒光素、別藻青蛋白4種熒光劑進(jìn)行免疫標(biāo)記并進(jìn)行免疫分型檢測(cè)。每支試管加入1×106有核細(xì)胞，根據(jù)患者的白血病特點(diǎn)選擇合適的單克隆抗體，所有單克隆抗體均由美國(guó)BD公司提供，操作嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。至少收集10萬(wàn)個(gè)可供分析的有核細(xì)胞，采用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞收集，并采用配套軟件進(jìn)行分析。根據(jù)原始細(xì)胞抗原是否跨系表達(dá)、表達(dá)是否同步、表達(dá)強(qiáng)弱、表達(dá)是否丟失等判定是否為MRD，當(dāng)MRD≥0.01%時(shí)視為MRD陽(yáng)性，否則則視為陰性。同時(shí)以所有患者骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果作為對(duì)照，骨髓液涂片6～8張，吉姆薩-瑞氏染色后在顯微鏡油鏡下分類200個(gè)細(xì)胞，根據(jù)形態(tài)進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[3]中的相關(guān)內(nèi)容判定是否復(fù)發(fā)。

1.3 指標(biāo)觀察

以骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)（世界衛(wèi)生組織診斷標(biāo)準(zhǔn)，增生Ⅰ～Ⅱ級(jí)，原始細(xì)胞增多≥20%），對(duì)比FCM檢測(cè)的敏感性及特異性。隨訪12個(gè)月，統(tǒng)計(jì)患者的復(fù)發(fā)率，分析MRD陽(yáng)性、陰性與復(fù)發(fā)率的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FCM檢測(cè)結(jié)果

用FCM檢測(cè)AML患者88例，檢測(cè)敏感性為96.6%，特異性為33.3%；用FCM檢測(cè)ALL患者54例，檢測(cè)敏感性為88.9%，特異性為44.4%。見(jiàn)表1。

表1 FCM檢測(cè)AL的敏感性及特異性 [例/例（%）]

2.2 MRD與復(fù)發(fā)率的相關(guān)性

24例MRD陰性患者中有6例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為25.0%，118例MRD陽(yáng)性患者中有88例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為74.6%，MRD陽(yáng)性患者復(fù)發(fā)率顯著高于陰性患者（P＜0.05）。

3 討論

FCM的免疫分型是目前AL研究的基本手段之一，其能夠通過(guò)對(duì)MRD的檢測(cè)來(lái)進(jìn)行預(yù)后判斷[4]。有學(xué)者研究顯示，誘導(dǎo)治療能夠殺滅絕大多數(shù)的AL細(xì)胞，但難以徹底清除，部分患者會(huì)在化療緩解后仍表現(xiàn)出MRD陽(yáng)性直至復(fù)發(fā)，因此認(rèn)為MRD陽(yáng)性是評(píng)估化療緩解程度的重要因素[5]。臨床上對(duì)于AL的診斷和療效的判斷主要通過(guò)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)，雖然細(xì)胞學(xué)檢測(cè)能夠作為AL的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但仍存在一定的局限性，如每次骨髓穿刺獲取的標(biāo)本只能反映出該部分的骨髓情況，而且一般在患者體內(nèi)AL細(xì)胞數(shù)量＞1%時(shí)方能檢出[6]，而MRD則會(huì)持續(xù)存在并在外周血中有所體現(xiàn)，通過(guò)對(duì)MRD的檢查能夠更全面地反映AL患者的預(yù)后情況。此外，對(duì)于患者而言，骨髓穿刺的創(chuàng)傷性較大，而外周血取材較為方便，在這方面FCM檢測(cè)也具有一定的優(yōu)勢(shì)。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)CM對(duì)AL患者外周血檢測(cè)具有較高的敏感性，對(duì)AML和ALL檢測(cè)的敏感性分別為96.6%和88.9%。BUCCISANO等[7]將115例AML患者的外周血作為MRD的檢驗(yàn)對(duì)象，提示MRD的表達(dá)與患者的長(zhǎng)期預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果亦表明，24例MRD陰性患者中有6例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為25.0%，118例MRD陽(yáng)性患者中有88例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為74.6%，MRD陽(yáng)性患者復(fù)發(fā)率顯著高于陰性患者（P＜0.05），這提示MRD陽(yáng)性可能與骨髓中AL細(xì)胞的持續(xù)存在有關(guān)。但由于本研究隨訪時(shí)間僅為12個(gè)月，有30例患者持續(xù)提示MRD陽(yáng)性但骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)并未得出復(fù)發(fā)的結(jié)果，仍需作進(jìn)一步隨訪。但目前數(shù)據(jù)已經(jīng)能夠提示MRD陽(yáng)性患者具有極高的復(fù)發(fā)概率，在化療后仍需追蹤觀察，這也反映了MRD是一個(gè)提示AL預(yù)后的重要因素。COUSTAN-SMITH等[8]的研究也顯示以MRD 0.01%為界限，水平＞0.01%的患者3年復(fù)發(fā)率是水平＜0.01%患者的3倍以上，因此認(rèn)為可以根據(jù)MRD檢驗(yàn)水平來(lái)進(jìn)行預(yù)后分級(jí)，并積極采取預(yù)防化療方案，如果MRD持續(xù)陰性則可以停止治療，如果MRD持續(xù)陽(yáng)性則考慮改變化療方案、增強(qiáng)化療或進(jìn)行骨髓移植[9]。有研究對(duì)外周血和骨髓中的MRD水平進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者會(huì)因?yàn)榧膊☆愋汀⒅委煼桨干踔翙z驗(yàn)時(shí)間的不同而發(fā)生變化，但一直保持一定的比例關(guān)系[10-12]。PAWINSKA等[13]的研究認(rèn)為AL患者的外周血MRD檢測(cè)與骨髓檢測(cè)具有相同的意義，同時(shí)進(jìn)行外周血和骨髓MRD檢驗(yàn)?zāi)軌蛴行岣邫z出率。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)ALL患者的外周血和骨髓MRD檢驗(yàn)結(jié)果具有較好的一致性，雖然骨髓檢驗(yàn)的檢出率要略高于外周血，但采用外周血MRD檢驗(yàn)同樣可以用于評(píng)價(jià)ALL患者的預(yù)后情況[14-15]。

綜上所述，F(xiàn)CM檢測(cè)AL患者外周血細(xì)胞具有較好的敏感性，在AL復(fù)發(fā)率評(píng)估中也有一定的臨床意義。

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