李未思

（四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室，四川成都 610000）

CHO細(xì)胞（中華倉鼠卵巢細(xì)胞，Chinese Hamster Ovary Cells）是廣泛應(yīng)用的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，目前已上市、進(jìn)入臨床和臨床前研究階段的大部分治療性單克隆抗體采用該表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)。用于生產(chǎn)過程的細(xì)胞培養(yǎng)工藝應(yīng)能持續(xù)穩(wěn)定地生產(chǎn)出質(zhì)量一致的合格產(chǎn)品，同時具有較好的生產(chǎn)效率和效益。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收獲液經(jīng)純化工序制得原液，原液需根據(jù)相關(guān)法規(guī)要求，以及基于產(chǎn)品安全性和有效性的風(fēng)險評估來確定其關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Critical Quality Attributs，CQAs）。其中，與細(xì)胞培養(yǎng)工藝密切相關(guān)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性檢測項目有抗體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、糖型分布、聚體情況、電荷變異情況、宿主蛋白/DNA含量等。收獲液中上述項目相關(guān)雜質(zhì)的含量多寡直接影響純化工序的難度和收率，其中不同糖型的抗體在現(xiàn)有生產(chǎn)工藝中很難有效分離，因此，雜質(zhì)的含量必須從細(xì)胞培養(yǎng)工序中加以控制。在保障抗體質(zhì)量的前提下，應(yīng)同時提高抗體表達(dá)量、抗體生成速率、細(xì)胞活性密度至合適程度，優(yōu)化操作參數(shù)和流程，以提高生產(chǎn)過程的效率、穩(wěn)定性和安全性。本文從上述角度出發(fā)，對CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝中的主要影響因素和需要注意的問題進(jìn)行探討。

1 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是CHO細(xì)胞生長、產(chǎn)物表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)，培養(yǎng)基的選擇應(yīng)充分考慮細(xì)胞株種系特點和產(chǎn)品要求。根據(jù)加入時機及目的不同，培養(yǎng)基可分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基主要用于細(xì)胞早期增殖階段，補料培養(yǎng)基主要用于早期增殖和表達(dá)階段，應(yīng)根據(jù)不同階段細(xì)胞的營養(yǎng)需求和代謝來選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基。同時，化學(xué)成分確定、無動物來源、無蛋白已成為當(dāng)今培養(yǎng)基的發(fā)展趨勢，可帶來安全性、穩(wěn)定性以及法規(guī)方面的優(yōu)勢和便利。

目前，已有多種商品CHO細(xì)胞培養(yǎng)基，可滿足不同細(xì)胞系、生產(chǎn)階段的需求，同時，定制培養(yǎng)基也已投入生產(chǎn)應(yīng)用。與非定制的商品培養(yǎng)基相比，定制化培養(yǎng)基可針對具體細(xì)胞株進(jìn)行精準(zhǔn)優(yōu)化，且生產(chǎn)企業(yè)掌握配方，可靈活選擇各有資質(zhì)的廠家進(jìn)行定制，達(dá)到提高產(chǎn)品質(zhì)量與產(chǎn)量，降低培養(yǎng)基成本，提高供應(yīng)源穩(wěn)定性的目的。

有多種途徑進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化。（1）采用混料設(shè)計，直接采用商品培養(yǎng)基進(jìn)行混料實驗，可在較短時間內(nèi)篩選出較好的組合；（2）向培養(yǎng)基內(nèi)添加氨基酸、生物因子、維生素、微量元素等物質(zhì)，從中選取對所考察質(zhì)量屬性有較大影響的物質(zhì)，并進(jìn)行下一步優(yōu)化；(3)對培養(yǎng)基成分及細(xì)胞代謝進(jìn)行分析，從營養(yǎng)物質(zhì)缺失和代謝廢物累積兩方面明確限制因子，針對性補加或設(shè)法清除相關(guān)物質(zhì)，并可通過細(xì)胞代謝特點確定補料策略，以及定制培養(yǎng)基各成分比例[1-2]。同時，應(yīng)考察培養(yǎng)基成分對抗體質(zhì)量屬性，如糖型等的影響[3]。在小規(guī)模高通量系統(tǒng)中完成初步優(yōu)化后，應(yīng)在中試生物反應(yīng)器中進(jìn)行驗證，以確認(rèn)新配方在生產(chǎn)中的適用性。

2 培養(yǎng)參數(shù)

CHO細(xì)胞培養(yǎng)的主要培養(yǎng)參數(shù)有溫度、pH、轉(zhuǎn)速、溶氧等。現(xiàn)有CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝廣泛采用變溫培養(yǎng)，即細(xì)胞生長增殖及產(chǎn)物表達(dá)階段采在不同溫度下培養(yǎng)。一般在指數(shù)生長后期降低培養(yǎng)溫度，可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，延緩細(xì)胞死亡，提高抗體生成速率，延長培養(yǎng)時間，達(dá)到提高總表達(dá)量的效果。與變溫培養(yǎng)類似，也可對pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，使細(xì)胞代謝方式從增殖階段向產(chǎn)物表達(dá)階段轉(zhuǎn)變。需要注意的是，溫度和pH的變化可影響抗體的糖型、聚體、電荷變異等方面，需進(jìn)行相應(yīng)的考察[4-6]。

大多數(shù)現(xiàn)有CHO細(xì)胞單抗生產(chǎn)平臺使用攪拌式生物反應(yīng)器進(jìn)行產(chǎn)物表達(dá)。在培養(yǎng)過程中，攪拌式生物反應(yīng)器通過攪拌槳攪拌和氣體分布器通氣進(jìn)行傳質(zhì)，來滿足細(xì)胞對氧氣的需求，同時去除多余的二氧化碳，維持反應(yīng)器內(nèi)各處溫度、溶氧、pH、營養(yǎng)物質(zhì)濃度等培養(yǎng)條件的均一性。然而，過大的攪拌和通氣速率會對細(xì)胞造成剪切傷害，降低密度和活性，影響產(chǎn)物質(zhì)量，尤其是在大型生物反應(yīng)器中，維持足夠的氧氣傳遞系數(shù)和較短的混合時間的同時，應(yīng)充分考慮剪切傷害。

反應(yīng)器培養(yǎng)中CHO細(xì)胞所受到的剪切傷害主要來自攪拌槳的機械擠壓，培養(yǎng)液中的渦旋和氣泡破裂產(chǎn)生的表面張力。為避免機械擠壓和渦旋的剪切傷害，槳尖速度不應(yīng)超過CHO細(xì)胞的耐受值；渦旋的最小尺度（即Kolmogorov尺度）應(yīng)大于細(xì)胞的最大直徑，以避免細(xì)胞在多個渦旋之間受到切向剪切。槳尖速度與攪拌轉(zhuǎn)速成正相關(guān)，Kolmogorov尺度與攪拌轉(zhuǎn)速成負(fù)相關(guān)，因此需將轉(zhuǎn)速控制在一定范圍內(nèi)。氣泡破裂產(chǎn)生的表面張力可殺死附著在其表面的細(xì)胞，加入表面活性劑可減少氣泡表面的細(xì)胞附著；適當(dāng)?shù)耐饬亢蜌馀莩叽缫材芙档蜌馀萜屏训挠绊懀苤朴跉怏w分布器的規(guī)格尺寸和反應(yīng)器的混合性能，因此在配置設(shè)備時應(yīng)及早結(jié)合工藝進(jìn)行考察。

3 工藝放大

由于時間及成本的原因，反應(yīng)器培養(yǎng)工藝實驗一般先在小型反應(yīng)器中進(jìn)行，再逐步放大至中試及生產(chǎn)規(guī)模。同時，可以使用小型反應(yīng)器模擬現(xiàn)有大規(guī)模生產(chǎn)中的部分工藝參數(shù)，即為縮小模型[7]。工藝放大過程中，應(yīng)確保抗體關(guān)鍵質(zhì)量屬性及表達(dá)量、細(xì)胞密度、活性等主要指標(biāo)的穩(wěn)定性。在不同的培養(yǎng)規(guī)模下，溫度、pH、流加策略一般不進(jìn)行改變，但攪拌速度和通氣速率等因素受體積影響，需要遵循一定的變化準(zhǔn)則。工藝放大/縮小通常采用相同單位體積功率P/V、傳質(zhì)系數(shù)kLa等作為準(zhǔn)則。由于P/V ∝ P0N3D5，kLa∝ (P/V)αUgβ（其中 P0為攪拌槳功率數(shù)，N為攪拌轉(zhuǎn)速，D為攪拌槳直徑，Ug為通氣速率，α、β為常數(shù)，由實驗得出）[8]，當(dāng)P/V或kLa取值固定時，可得出培養(yǎng)規(guī)模放大/縮小后的攪拌轉(zhuǎn)速和通氣速率。但正如前面提到的，攪拌轉(zhuǎn)速和通氣速率的取值必須考慮到細(xì)胞的耐受范圍和反應(yīng)器的硬件條件，同時，大型生物反應(yīng)器培養(yǎng)中存在的傳質(zhì)不均一問題，可將兩個小型反應(yīng)器通過管路及蠕動泵串聯(lián)，或通過在小型反應(yīng)器上加裝平推流反應(yīng)器（Plug flow reactor，PFR）等裝置[9]，模擬大型生物反應(yīng)器不同區(qū)域之間物質(zhì)的混合來進(jìn)行考察。

4 結(jié)語

以CHO細(xì)胞為表達(dá)系統(tǒng)的大規(guī)模培養(yǎng)工藝在治療性單克隆抗體生產(chǎn)過程中起著關(guān)鍵作用。由于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的特殊性和復(fù)雜性，以及國家監(jiān)管機構(gòu)對生物制品質(zhì)量要求日趨嚴(yán)格，生產(chǎn)廠家需要利用飛速發(fā)展的新技術(shù)和方法，開發(fā)高質(zhì)量、高表達(dá)、高效率、可穩(wěn)定生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)工藝，以期在競爭日益激烈的治療性單克隆抗體市場中脫穎而出。

[1]Robitaille J, Chen J, Jolicoeur M. A Single Dynamic Metabolic Model can Describe mAb Producing CHO Cell Batch and Fed-Batch Cultures on Different Culture Media[J]. PloS one,2015,10(9):e0136815.

[2]Kishishita S, Katayama S, Kodaira K, et al. Optimization of Chemically Defined Feed Media for Monoclonal Antibody Production in Chinese Hamster Ovary Cells[J].Journal of Bioscience and Bioengineeri ng,2015,120(1):78-84.

[3]Fan Y, Jimenez Del Val I, Müller C, et al. Amino Acid and Glucose Metabolism in Fed-Batch CHO Cell Culture Affects Antibody Production and Glycosylation[J].Biotechnology and bioengineeri ng,2015,112(3):521-535.

[4]Kou T C, Fan L, Zhou Y, et al. Increasing the Productivity of TNFR-Fc in GS-CHO Cells at Reduced Culture Temperatures[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering,2011,16(1):136-143.

[5]Gomez N, Subramanian J, Ouyang J, et al. Culture Temperature Modulates Aggregation of Recombinant Antibody in CHO Cells[J].Biotechnology and bioengineering,2012,109(1):125-136.

[6]Pacis E, Yu M, Autsen J, et al. Effects of Cell Culture Conditions on Antibody N-linked Glycosylation-what Affects High Mannose 5 Glycoform[J]. Biotechnology and Bioengineeri ng,2011,108(10):2348-2358.

[7]Sieck J B, Cordes T, Budach W E, et al. Development of a Scale-Down Model of Hydrodynamic Stress to Study the Performance of an Industrial CHO Cell Line under Simulated Production Scale Bioreactor Conditions[J]. Journal of Biotechnology,2013,164(1):41-49.

[8]Moutafchieva D, Popova D, Dimitrova M, et al. Experimental Determination of the Volumetric Mass Transfer Coefficient[J]. Journal of Chemical Technology and Metallurgy,2013,48(4):351-356.

[9]劉金濤,王星懿,范里,等.大型反應(yīng)器內(nèi)pH不均一性對CHO細(xì)胞流加培養(yǎng)過程的影響[J].生物技術(shù)通報,2015,31(10):236-241.