microRNA的分析檢測方法的研究進(jìn)展

吳筱原，彭書傳

（合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽合肥 230009）

microRNA是真核生物體內(nèi)一類短小、內(nèi)源性、無編碼的單鏈RNA分子，通常由18～22個(gè)核苷酸組成[1]。在細(xì)胞進(jìn)化的過程中，microRNA高度保守，是轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控因子，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、脂類代謝等過程中發(fā)揮著重要作用[2]。臨床研究表明，microRNA的異常表達(dá)與很多疾病都密切相關(guān)，如癌癥、神經(jīng)性病癥以及糖尿病等[3-5]。因此實(shí)現(xiàn)對(duì)microRNA的高精度高靈敏度檢測在科研領(lǐng)域以及臨床試驗(yàn)都十分必要。由于microRNA本身十分短小、序列之間的高度同源性，檢測microRNA面臨諸多挑戰(zhàn)[6]。

近年來，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)microRNA的定量檢測，研究人員建立了多種靈敏度高、特異性強(qiáng)、高通量的檢測方法。本文結(jié)合目前microRNA的檢測方法進(jìn)行詳細(xì)的闡述和分析，為今后開展microRNA的研究提供參考。

1 microRNA早期檢測方法

1.1 Northern blotting

Northern blotting法是建立在固相雜交基礎(chǔ)上定量檢測microRNA的方法[7]。該法原理是將DNA探針和硝酸纖維素膜上的microRNA進(jìn)行雜交，洗膜顯影后根據(jù)條帶進(jìn)行分析。該法缺陷在于操作過程繁瑣，無法實(shí)現(xiàn)高通量，在實(shí)驗(yàn)過程中易造成環(huán)境危害。此外，該法的靈敏度和特異性較差且耗時(shí)耗量。

1.2 微陣列法

微陣列技術(shù)是基于雜交原理檢測microRNA的方法，能夠同時(shí)檢測多個(gè)樣品，高通量分析。該法通過熒光標(biāo)記的microRNA與固定在芯片上的DNA探針雜交，經(jīng)熒光掃描獲取信號(hào)強(qiáng)度并結(jié)合相應(yīng)的軟件進(jìn)行microRNA的表達(dá)分析[8]。但微陣列法常伴有假陽性結(jié)果，重復(fù)性差、靈敏度較低，且芯片的制作和檢測費(fèi)用高。

1.3 定量-逆轉(zhuǎn)錄PCR法

定量-逆轉(zhuǎn)錄PCR法是檢測較低水平microRNA的有力工具[9]，該法的原理是將microRNA反轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，通過實(shí)時(shí)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量，實(shí)現(xiàn)對(duì)microRNA的定量分析。此法會(huì)引入pri-microRNA或pre-microRNA，導(dǎo)致無法精確定量，檢測成本較高。

2 microRNA檢測新方法

由于microRNA傳統(tǒng)檢測方法存在操作復(fù)雜、浪費(fèi)樣品、靈敏度特異性差等弊端，促使研究者在原先的基礎(chǔ)上發(fā)展出更多新的方法滿足科研領(lǐng)域和臨床試驗(yàn)的需求。

2.1 滾環(huán)擴(kuò)增法

滾環(huán)擴(kuò)增法（RCA）是一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，引物和環(huán)狀ssDNA結(jié)合之后，在DNA聚合酶的作用下，實(shí)現(xiàn)DNA的連續(xù)擴(kuò)增產(chǎn)生大量同序列的線性單鏈DNA，結(jié)合相應(yīng)的DNA檢測技術(shù)即可間接地檢測microRNA[10]。RCA包括直接滾環(huán)擴(kuò)增和鎖探針-滾環(huán)擴(kuò)增，該法操作簡便，無需特殊裝置，但由于擴(kuò)增的時(shí)間較長，模板的合成難度較大、成本高，使用率并不高[3]。

2.2 基于指數(shù)擴(kuò)增的檢測方法

指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（EXPAR）是一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，能夠在短時(shí)間將十幾個(gè)堿基的核苷酸在恒溫條件下擴(kuò)增106倍以上[11]。模板的兩端序列都與靶分子互補(bǔ)配對(duì)，中間夾雜一段被切口酶識(shí)別序列的互補(bǔ)序列。靶向microRNA退火并與模板的3’端雜交后，在DNA聚合酶的作用下延伸形成含有靶向microRNA的雜化物，并在切口酶作用下釋放大量單鏈DNA，該ssDNA與靶向microRNA序列完全相同，作為引物觸發(fā)新的EXPAR，如此循環(huán)完成指數(shù)擴(kuò)增。該法檢測速度快、特異性好，已被越來越多地應(yīng)用到研究領(lǐng)域，但由于模板單一、無法實(shí)現(xiàn)高通量檢測，研究者們又不斷提出改進(jìn)措施。

2.3 酶輔助檢測microRNA

在普通的探針雜交法檢測microRNA的過程中，由于缺少信號(hào)放大過程，檢測強(qiáng)度一般較弱、靈敏度較低。酶輔助的檢測方法通過工具酶的輔助能夠?qū)⒌玫降臋z測信號(hào)進(jìn)一步放大或擴(kuò)增，提高檢測的靈敏度。該法首先根據(jù)靶分子的序列人工合成一段特異性探針，讓探針與靶分子混合形成雜化體結(jié)構(gòu)，借助切口酶剪切探針產(chǎn)生檢測信號(hào)，同時(shí)釋放出靶分子，循環(huán)反復(fù)實(shí)現(xiàn)EXPAR，放大檢測信號(hào)。由于該法操作簡便條件溫和，已被逐步應(yīng)用于microRNA的定量檢測中。但同時(shí)探針設(shè)計(jì)的難度較大，模板退火會(huì)造成假陽性結(jié)果。

2.4 基于納米技術(shù)的microRNA檢測法

納米金顆粒因其具有較高的電子密度、優(yōu)良的介電特性以及高效的催化作用等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用作檢測microRNA的載體。納米金比色法檢測microRNA的原理是基于它在分散狀態(tài)下呈紅色，團(tuán)聚后呈藍(lán)色。在沒有目標(biāo)microRNA存在的情況下，納米金通過DNA探針交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出紅色；當(dāng)目標(biāo)microRNA存在時(shí)，DNA探針能夠識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)microRNA，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，此雙鏈結(jié)構(gòu)中的DNA隨后被DSN特異性識(shí)別并切割，釋放microRNA和納米金，溶液變紫色。在DSN酶作用下引發(fā)擴(kuò)增循環(huán)，檢測信號(hào)得到放大，此法的檢測限可達(dá)到10-16mol/L[12]。

雖然基于納米技術(shù)的檢測方法靈敏度高、特異性好、能夠?qū)崿F(xiàn)高通量檢測，但是由于納米顆粒本身易團(tuán)聚，受溶液狀態(tài)影響較大，如pH、離子濃度，納米顆粒表面附著的探針數(shù)量也會(huì)影響其檢測結(jié)果。

2.5 測序法

對(duì)于未知序列的microRNA的檢測通常需要借助測序法，如克隆測序、新一代高通量測序、Nano String讀數(shù)等，這些技術(shù)可用于分析特殊樣品中microRNA的種類，樣品經(jīng)擴(kuò)增后再測序，根據(jù)microRNA的表達(dá)譜對(duì)其定量[13]。

新一代大規(guī)模測序技術(shù)主要有羅氏公司的454焦磷酸測序技術(shù)、Illumina公司的Solexa基因組測序[14]。這兩種技術(shù)均可實(shí)現(xiàn)對(duì)microRNA的定量檢測，而且能夠檢測已知microRNA的長度和序列的變化以及表達(dá)程度。這兩種方法的步驟相近，即準(zhǔn)備樣品后制備模板繼而測序?qū)⒌玫降慕Y(jié)果進(jìn)行比對(duì)[15]。雖然新一代測序技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)微量樣品中microRNA的高通量檢測，但由于對(duì)儀器設(shè)備有較高的要求，未能被廣泛應(yīng)用到實(shí)際當(dāng)中。

2.6 納米孔單通道技術(shù)檢測microRNA

納米孔單通道技術(shù)是根據(jù)電流脈沖信號(hào)對(duì)待測物進(jìn)行檢測的電化學(xué)傳感技術(shù)。近幾年來，通過納米孔檢測microRNA的方法也被廣泛應(yīng)用。目前，多數(shù)納米孔檢測方法都是基于構(gòu)建microRNA-DNA雜化體的形式來直接檢測microRNA，納米孔的直徑一般只允許單鏈DNA或microRNA穿過，在形成雜化體后，其穿越納米孔的阻滯時(shí)間和電流幅值發(fā)生改變，據(jù)此實(shí)現(xiàn)檢測目的。該法能夠達(dá)到較低的檢測限，抗干擾性好，但較之于PCR擴(kuò)增，存在低通量的缺陷導(dǎo)致不能被廣泛的應(yīng)用于臨床研究。

3 總結(jié)與展望

microRNA在細(xì)胞的增殖、發(fā)育和凋亡等一系列過程中起著關(guān)鍵作用，其異常表達(dá)與多種疾病密切相關(guān)。因此，microRNA可作為癌癥診斷和預(yù)測的生物標(biāo)志物，也可作為新藥物潛在的作用對(duì)象。實(shí)現(xiàn)對(duì)microRNA的定量檢測對(duì)于多種疾病的前期診斷以及新藥物開發(fā)都具有重要的意義，microRNA的定量檢測方法主要集中在各種探針設(shè)計(jì)和標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合微陣列芯片、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、滾環(huán)擴(kuò)增、指數(shù)擴(kuò)增、酶輔助、高通量測序和納米孔單通道技術(shù)等聯(lián)用來實(shí)現(xiàn)高靈敏度和特異性檢測。隨著新技術(shù)的發(fā)展，新一代測序技術(shù)的普及，microRNA的檢測技術(shù)會(huì)更廣泛地應(yīng)用在科研領(lǐng)域及臨床試驗(yàn)中。

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