一株膽固醇富集物中細菌的鑒定

金卓，蔣凱，金珂，梁晨，梁琳潔，丁濱

（浙江中醫藥大學，浙江杭州 310053）

隨著經濟的發展、人口的增長，城市污水、養殖業及相關制藥產業垃圾等含有的固醇類化合物對生態平衡破壞的問題逐漸突顯[1-2]。膽固醇、糞固醇、膽汁酸、甚至雌二醇等固醇類化合物已經被作為生物標志物來評價環境污染物的類型及污染程度[2-4]。據統計，每個人每天排出固醇類化合物的總量在0.2～1 g[3]。糞固醇的長側鏈在化學或生物因素的作用下極易斷裂，形成固醇類激素。2014年，Sistiaga和Goldberg等人從遠古人類生活遺跡的化石中分離到了固醇類化合物[5]。加拿大學者跟蹤調查的結果表明，此類化合物可在土壤中沉積超過1年[3]。

細菌細胞中缺乏固醇類化合物，卻可以利用這類化合物作為唯一碳源生長繁殖。有研究證明，在有氧條件下，活性污泥中的微生物需要約20天才可以降解掉生活污水中的固醇類污染物，包括固醇類激素[3,6]。2003年，Tarlera和Denner從環境中分離到1株能夠在反硝化條件下降解膽固醇的細菌，經鑒定發現其為β-變形菌門的一個新屬，被命名為Sterolibacteriumdenitrificans Chol-1ST（DSMZ 13999）[7]，與已知能夠降解單苯環類化合物的Thauera屬和Azoarcus屬[8]細菌的親緣關系比較近。該細菌能夠利用的碳源有限，目前發現它僅能利用膽固醇以及少量的結構類似物為碳源生長。該屬至今僅有兩個成員，另一株是尚未鑒定和命名的菌株72Chol[9]。豐富的研究對象是研究膽固醇在無氧環境中代謝過程的前提，筆者從以膽固醇為底物的生活污水富集物中分離到了一株細菌，并對該細菌進行了系統分類鑒定。

1 試劑及儀器

用于培養基配制的化學及生化試劑均購自華東醫藥股份有限公司（杭州），16s rDNA細菌鑒定PCR試劑盒由寶生物工程（大連）有限公司提供；PCR儀由美國伯樂公司提供；電泳儀（DYY-6B）購自北京市六一儀器廠；分光光度計（ZF-2）購于上海嘉鵬科技有限公司；生化培養箱由寧波海曙賽福實驗儀器廠提供。

2 實驗方法

2.1 細菌的無氧富集、分離與純化

將土壤樣品富集在以硝酸鹽為電子受體、含1 g膽固醇的MS培養基中1年。將富集培養物混勻后連續梯度稀釋純化4次，顯微鏡下觀察富集物中的細菌形態均一、一致。上述過程及使用的培養基均經過充CO2保持無氧環境。

2.2 克隆PCR及細菌分子生物學鑒定

將離心收集的菌泥重新懸浮于無菌水中，加熱煮沸后迅速冰浴，反復兩次使細胞溶解，制成細菌裂解液。加入含一對序列為27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和519R GWATTACCGCGGCKGCTG的引物的PCR反應體系中，依次經過94℃變性、55℃退火、72℃延伸，循環35次，體外擴增該菌落的16s rDNA序列。PCR反應產物經1%瓊脂糖電泳檢測，并由上海生物工程有限公司（上海）測序。獲得的序列在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov網站進行比對分析。

2.3 革蘭氏染色及細菌形態觀察

以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對照，先后經過結晶紫初染、碘液媒染、酒精脫色、番紅復染4個步驟，干燥載玻片，在油鏡下觀察。

2.4 最適培養條件

（1）將細菌的新鮮培養物按1∶20比例分別接種于pH為4、5、6、7、8、9和10的MS培養基中，放入搖床中30℃、180 r/min培養，根據培養物OD600的變化判斷細菌生長最適pH值。（2）將細菌接種于最適pH的MS培養基中，分別放置在20、30、40℃及50℃培養箱中培養，根據培養物OD600的變化判斷細菌生長最適溫度。（3）將細菌接種于含不同濃度梯度底物的培養基中，根據培養物OD600值的變化判斷細菌生長最適底物濃度。以上實驗每組各設重復3個。將細菌的新鮮培養物按1∶50比例接種于最適培養基中，于最適溫度下搖床培養，并確保硝酸鹽過量，在不同時間段取出培養物，測培養物OD600值，計算代時。

2.5 底物代謝能力實驗

將細菌分別接種于含0.5%果糖、0.5%乳糖、0.5%棉子糖、0.5%葡萄糖、0.5%阿拉伯糖、0.5%木糖、0.5%乳糖、1 mmol/L苯酚、1 mmol/L膽酸鈉、0.5%甘油、10 mg膽固醇、1 mg苯并芘、1 mmol/L苯甲酸、1%辛烷（V/V）和1%環己烷（V/V）的最適培養基中，根據渾濁度變化判斷細菌是否具有代謝能力。

3 結果和分析

Thau-01為細小桿狀，革蘭氏陰性細菌。培養基最適pH為8，最適培養溫度為30℃，最佳底物濃度為4～8 mg/mL。在最適條件下底物濃度為8 mg/ml時細菌代時為56min。該細菌在反硝化條件下不能代謝甘油、果糖、乳糖、棉子糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、苯酚、苯甲酸、膽酸鈉和苯并芘等化合物，能代謝1%辛烷和環己烷。該細菌16s RNA編碼序列的前500個堿基與Thaueraaromatica和Sterolibacteriumdenitrificans strain Chol-1S同源性最高，為94%。此外，該菌與Georgfuchsiatoluolica strain G5G6，反硝化富集物中分離的兩個克隆NOA 1 F6和NOB 2 A10有92%的同源性。其中Strain Chol-1S是由澳大利亞的一個實驗室分離到的，該細菌為革蘭氏陰性細菌，短棒狀，細菌的一端有鞭毛一根，可運動，菌體上附著有纖毛，除固醇類化合物，該細菌僅可以代謝長鏈飽和脂肪酸[7]。T.aromatica是一類能夠在有氧和反硝化條件下降解代謝芳香類化合物的細菌，不善于利用糖類和固醇類化合物。Strain G5G6是2009年由荷蘭的實驗室在甲苯為底物、多種電子受體存在的厭氧條件下分離到的，該菌分別以三價鐵、硝酸為電子受體、以甲苯為底物生長，雖然也代謝固醇類化合物，卻不利用膽固醇[10]。將Thau-01與上述三個屬的細菌進行對比，認為Thau-01與Sterolibacteriumdenitrificans更相似，當然這一推測還需要經過進一步驗證。

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