植物黃酮醇生物合成關鍵基因研究進展

方 芳,王鳳忠

(中國農業科學院農產品加工研究所,北京 100193)

黃酮醇是廣泛存在于植物體內的一類重要的次生代謝產物和類黃酮化合物[1],其不僅具有抗氧化[2]、抗癌[3]、抗炎[4]等多種重要的生理功能,同時與植物的生長發育及色澤等外觀品質的形成密切相關[5-6],因此，黃酮醇作為對植物營養及外觀品質形成具有決定作用的一類重要的次生代謝產物，近年來在植物及食品等研究領域備受關注。

黃酮醇的生物合成是由苯丙烷類代謝途徑和類黃酮代謝途徑共同決定的,生物合成過程中需要苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(Cinnamate 4-hydroxylase,C4H)、4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate CoA ligase,4CL)、查爾酮合成酶(Chalcone synthase,CHS)、黃酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)等多個酶的共同作用與參與[7-8]。大量研究表明,PAL,C4H,4CL,CHS,FLS等基因的表達易受溫度[9-10]、光照[11-12]、水分[13]、鹽脅迫[14]或病原菌[15]等多種外源環境因素的作用從而影響植物黃酮醇的積累,因此，了解植物黃酮醇生物合成關鍵基因的研究進展對于有效調控植物黃酮醇的生物合成具有重要意義。本文綜述了植物黃酮醇生物合成關鍵基因的克隆、分布、特性及其對外源環境條件應答的最新研究進展,以期為植物黃酮醇的積累及調控提供參考依據。

1 相關基因研究進展

1.1 PAL基因

PAL是連接初生代謝和次生代謝的關鍵酶,也是苯丙烷類代謝途徑的第一個酶和限速酶[12,16]。其不僅是決定高等植物中多種次生代謝產物生物合成的關鍵酶[12,17-18],同時與植物生長發育[18-19]、外觀與營養品質形成[18,20]及對逆境脅迫的抗性[14-15,17]等的形成密切相關。PAL基因是由Koukol等[21]在1961年首次從大麥中發現并提取的,之后有關PAL基因的克隆及其表達特性的研究迅速展開[22]。目前有關PAL基因克隆的研究多集中于被子植物中[15],其基因全長或片段已在擬南芥[23]、大豆[24]、小麥[25]、洋蔥[19]、芒果[26]、藍莓[27]等多種糧食及經濟作物中得到克隆。由于PAL與植物木質化及木質素的生物合成密切相關,因此有關PAL基因的克隆與表達研究在木質素依賴及易木質化植物中備受關注。劉佳等為研究南瓜種皮木質素合成機理,對有殼南瓜(Cucurbitapepo)種皮的PAL基因(CP-PAL)進行克隆并獲得全長1720 bp,開放閱讀框1359 bp,可編碼452個氨基酸的基因序列。實時熒光定量PCR分析發現在種皮發育過程中,PAL基因在裸仁南瓜中的表達量顯著低于其在有殼南瓜中的表達量,推測CP-PAL基因可能通過參與調控種皮木質素的合成來影響美洲南瓜裸粒品種的種皮發育[22]。李丹青等[28]為研究杏鮑菇貯藏過程中的木質化機理,對其木質化關鍵酶基因進行克隆及表達分析,從杏鮑菇中克隆得到序列全長為2441 bp、完整開放閱讀框為2229 bp、可編碼743個氨基酸的PAL基因(PePal),熒光定量PCR分析發現,在各貯藏溫度下,PePal基因表達水平與PAL活性及木質素含量變化趨勢一致,推測PePal基因的表達可能受溫度等環境因素誘導,在低溫貯藏條件下對杏鮑菇木質化發揮重要作用。

除基因的克隆研究外,由于PAL基因的表達水平與多酚及黃酮類化合物的積累密切相關[23,29],近年來有關其體內分布、特性、在植物生長發育及抵御逆境脅迫中的作用等方面的研究也備受關注[22]。Li等[12]從香鱗毛蕨(Dryopterisfragrans)中獲得了3個PAL基因片段(DfPAL1,DfPAL2,DfPAL3),發現DfPAL3在香鱗毛蕨的配子體及葉柄中大量表達,DfPAL1在葉柄中大量表達,而DfPAL2在葉子及葉柄中的表達量均較低,但其可受溫度及紫外線誘導。Ban等[18]對西洋梨(Pyruscommunis)中的PAL基因(PcPAL)進行克隆并對其在不同西洋梨品種和不同組織部位的表達模式進行分析,發現PcPAL基因的表達與品種、果實的發育階段和組織部位具有相關性,在西洋梨成熟后期,不同品種間的PcPAL基因的表達模式存在明顯差異,PcPAL基因的表達對Red Bartlett品種果肉的花色苷積累無影響,但與Red d’Anjou品種的花色苷積累密切相關。Yang等[16]對紅橘(CitrusreticulateBlanco)中的PAL基因(CrPAL1)進行克隆,經亞細胞定位發現其主要分布于質膜上,且其基因表達量在鐵離子脅迫下顯著升高。Mrázová等以豆科模式植物百脈根(Lotusjaponicas)為對象,研究鹽脅迫對其不同組織中PAL基因表達的影響,發現鹽脅迫會導致植物根部及葉片中的PAL基因表達發生顯著變化[14]。Zhang等[15]在研究大豆(Glycinemax(L.)Merr.)PAL基因對疫霉菌(Phytophthorasojae)的應答機制時發現,大豆疫霉菌對GmPAL2.1基因具有誘導作用,GmPAL2.1基因反之可顯著提高轉基因大豆作物對大豆疫霉菌的抗性。

1.2 C4H基因

C4H是苯丙烷類代謝途徑的第二個關鍵酶[12,30]。作為細胞色素P450加氧酶家族CYP73亞家族中的一員,其可催化香豆酸轉化為反式肉桂酸,參與包括類黃酮及木質素等多種植物次生代謝產物的生物合成[30-31],并與植物抵御逆境脅迫的抗性形成密切相關[13]。C4H基因是在1967年首次從豌豆苗的頂芽中發現的[32],之后有關C4H基因的研究迅速展開[22]。盡管P450加氧酶的不穩定性及其膜結合特性給C4H基因的分離帶來較大困難[30],但目前其基因全長或片段已在棉花[33]、煙草[34]、青稞[35]、紫莖澤蘭[36]、碭山酥梨[37]等多種植物中得到克隆和表達。

關于植物C4H基因的研究，除對不同物種中的相關基因進行克隆與表達研究外,有關其在植物體內的分布、特性、與植物生長發育的關系及其對逆境脅迫的應答反應等研究也在穩步推進。程俊等[37]在對碭山酥梨果實C4H基因進行克隆的同時對其表達特性進行分析,發現PbC4H基因在果實發育過程中表達量呈現先升高后降低的趨勢。Xia等[31]對野茶樹(Camelliasinensis)中的三個C4H基因(CsC4Ha,CsC4Hb及CsC4Hc)分別進行克隆與識別,發現CsC4Ha在茶樹第四葉片高度表達,CsC4Hb在嫩葉中高度表達,而CsC4Hc則在嫩莖中高度表達,推測3個CsC4H基因在植物體內可能分別具有不同的亞細胞定位和生理功能。趙樂等[13]對獨行菜(Lepidiumapetalum)C4H基因進行克隆,發現LaC4H基因的表達量在莖中最高,其次為葉、花和根,茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)對葉中LaC4H基因表達具有誘導作用,且其表達量與黃酮含量呈現明顯正相關[38]。Abdollahi等[13]在研究干旱脅迫對羅勒苯丙烷類代謝途徑中關鍵基因的影響時發現,在田間含水量為50%時,C4H基因的表達量明顯降低。有關C4H基因的研究報道除在被子植物中進行外,近年來在蕨類植物及苔蘚類植物中也在開展探索性研究并取得一定研究進展[12,30]。Li等[12]從香鱗毛蕨(Dryopterisfragrans)中獲得了C4H基因片段(DfC4H),發現DfC4H在香鱗毛蕨的配子體及葉柄中高達表達,同時可受4、35 ℃及紫外照射的誘導。Liu等[30]根據現有地錢植物轉錄組序列信息對苔蘚植物中3個C4H基因PaC4H、MpC4H1和MpC4H2進行克隆和功能特性分析,發現PaC4H基因可受水楊酸或UV輻射等非生物脅迫條件的誘導而大量表達。由此可見,C4H作為苯丙烷類代謝途徑的第二個關鍵酶,其相關基因的表達不僅與植物的組織部位、生長發育階段等密切相關,同時受溫度、光照、水分及植物激素等多種外源環境因素的誘導,并與植物木質素及類黃酮等次生代謝產物的生物合成密切相關。

1.3 4CL基因

4CL是苯丙烷類代謝途徑中除PAL和C4H外又一關鍵限速酶,同時也是連接苯丙烷代謝途徑和木質素生物合成途徑的關鍵酶,其可將羥基肉桂酸轉化為羥基肉酰-CoA酯,在參與木質素生物合成的同時,還對類黃酮等次生代謝產物的生物合成產生重要影響[39]。4CL基因是在1987年首次從歐芹中發現并克隆的[40],之后有關4CL基因的研究在不同植物中迅速展開[41]。目前4CL的基因全長或片段已在擬南芥[42]、銀杏[43]、葛根[44]、沙漠白楊[45]、白花前胡[41]等多種食用及藥用植物中得到克隆。與此同時,由于前期有關4CL基因的克隆和表達多在裸子植物及被子植物中開展[46],近年來在蕨類植物及苔蘚植物中也出現了有關4CL基因克隆的相關報導。Li等[47]從香鱗毛蕨(Dryopterisfragrans)中克隆了4CL基因Df4CL,并對其表達模式進行分析和預測,為蕨類植物次生代謝產物的積累及調控研究提供了理論基礎。Gao等[46]從苔類植物鈍鱗紫背苔(Plagiochasmaappendiculatum)中克隆得到全長為1644 bp,可編碼547個氨基酸的4CL基因Pa4CL,并發現水楊酸或茉莉酮酸甲酯對其轉錄行為具有誘導作用。

因4CL基因的表達與植物類黃酮及木質素的生物合成密切相關,而植物類黃酮和木質素又是決定植物及植物源食品營養及外觀品質的重要因素,因此研究4CL基因在植物中的分布、表達特性、在植物生長發育過程中的變化及其對外源環境因素的應答等，對于有效保持或改善植物及植物源食品的品質具有重要意義,近年來相關研究也備受關注。裴艷梅等[39]從無核小棗果實中克隆得到4CL基因Zj4CL。經實時熒光定量PCR分析發現,Zj4CL基因的表達與果實發育時間密切相關。董麗麗等[48]對紅玉石籽石榴(Punicagranatumcv. Hongyushizi)的4CL基因進行克隆,獲得4CL同源基因Pg4CL,發現Pg4CL基因在不同石榴品種中的表達量存在顯著差異,在石榴葉片和果皮中的表達量較高,種皮中的表達量最低,而在石榴籽粒發育過程中,表達量呈現先升高后降低的趨勢。Zhang等[45]從沙漠白楊和鹽敏感型白楊品種中共識別到20個4CL基因,經轉錄譜分析發現,鹽脅迫條件下沙漠白楊品種中的4CL1,4CL11和4CL12三個基因的表達與鹽敏感型品種間存在顯著差別,推測沙漠白楊的抗鹽性與4CL基因的進化有關。Li等[9]在研究苯丙烷代謝途徑關鍵基因對枇杷(Eriobotryajaponica)果肉木質化的影響時發現,Ej4CL基因是導致枇杷果肉木質化的關鍵基因,同時Ej4CL基因對低溫反應十分敏感,可被熱處理或低溫條件抑制。由此可見4CL基因的表達與植物品種、組織部位及生長發育階段等多種因素密切相關,同時可受溫度及鹽分等多種環境因素的影響,選擇合適的環境條件對植物4CL基因進行調控對于保持或提高植物品質具有重要作用。

1.4 CHS基因

CHS作為植物聚酮合酶家族中的一員,是植物類黃酮化合物生物合成途徑的第1個關鍵酶[49-50]。其可將1分子4-香豆酰輔酶A與3分子丙二酰輔酶A催化生成黃酮類物質的骨架結構-查爾酮,并進一步衍生出不同種類的類黃酮化合物[51]。CHS基因是在1983年首次從歐芹中發現并分離的[52],因其與植物類黃酮化合物的生物合成密切相關[53],同時在植物的花粉育性、UV防護及抗病性等方面發揮重要作用[54-55],其后有關其基因的研究迅速展開。目前CHS基因已在白菜類蔬菜[55]、花椰菜[54]、山葡萄[56]、桂花樹[53]、姜黃[51]等多種植物中得到克隆,在Genebank數據庫中有關植物CHS核苷酸序列的記載已有超過4000條[57]。

鑒于CHS基因與花色苷、黃酮醇等多種與植物外觀和營養品質相關的植物類黃酮化合物的生物合成密切相關[53],有關其表達特性及與逆境脅迫的關系研究近年來也備受關注。Ma等[53]從桂花樹(Osmanthusfragrans)中克隆得到CHS基因OfCHS,發現OfCHS基因在葉中的表達量明顯高于花瓣。Cao等[50]從水蕨(Ceratopteristhalictroides)中克隆得到CHS基因CtCHS,發現CtCHS基因表達可受UV輻射的誘導。Wei等[10]在研究熱空氣處理對櫻桃番茄果實的苯丙烷類代謝產物積累及其生物合成相關基因的表達量的影響時發現,熱空氣處理在促進黃酮醇等類黃酮代謝產物積累的同時,可顯著提高其LeCHS基因的表達及其對病原菌的抗性,推測熱空氣處理可通過提高代謝途徑上生物合成關鍵基因的表達量提高下游代謝產物的積累,進而促進果實抗病性的提高。由此可見,CHS作為類黃酮代謝途徑上的第一個關鍵酶,其不僅決定著下游多種類黃酮代謝產物的生物合成,同時其表達模式與植物種類、組織部位及植物的發育階段等密切相關,并受光照、溫度等多種外源因素的影響。通過選擇合適的外源環境因素對其表達模式進行誘導或調節,可對下游次生代謝產物的生物合成進行有效調控。

1.5 FLS基因

FLS為2-酮戊二酸鐵依賴酶家族中的一員,其可將二氫黃酮醇轉化為黃酮醇[58],是決定黃酮醇類物質生物合成反應最后一步的關鍵限速酶[59]。FLS基因是1993年首次從矮牽牛中發現并克隆的[60],其后在苦蕎[61]、銀杏[58]、黃芩[62]、枸杞[63]、觀賞海棠[64]、黃花苜蓿[65]等多種植物中均有關于FLS基因克隆的報道。目前,在Genebank中有關FLS核苷酸序列的記載已有100余條[57]。

作為植物黃酮醇生物合成的關鍵限速酶,FLS基因的表達與調控對黃酮醇類化合物的生物合成至關重要,因此近年來有關FLS基因的分布和表達特性,及外源環境條件對其誘導和調控的研究逐漸成為研究熱點。楊文婷等[59]根據紅花轉錄組中獲得的序列,采用RT-PCR法對紅花FLS基因進行克隆,獲得了長度為224 bp的基因片段,經比對發現該基因與其他物種的FLS基因具有較高同源性，并通過對紅花不同品種不同花期樣品進行熒光定量PCR分析發現,紅花FLS基因在吉紅油姊妹系的盛花期表達量最高。Xu等[58]對銀杏中的FLS基因進行克隆,獲得具有1023 bp開放閱讀框可編碼340個氨基酸的全長基因GbFLS,發現GbFLS在銀杏根、莖、葉和果實中均有表達,且其表達量受UV-B、脫落酸、低溫、蔗糖、水楊酸及乙烯利等多種非生物脅迫條件的誘導。Liu等[11]在研究UV-B對長相思葡萄類黃酮生物合成的影響時,以5個FLS基因(VvFLS1-5)為對象研究UV-B對其表達模式的影響,發現長相思葡萄中VvFLS4和VvFLS5基因具有轉錄活性,并受UV-B輻射的誘導。Zhang等[66]在研究外源環境條件對長葉紅沙(Reaumuriatrigyna)黃酮醇類化合物積累的影響時發現,NaCl和UV-B處理可顯著提高RtFLS1和RtFLS2基因的表達量,同時伴隨有蘆丁、楊梅酮等黃酮醇類物質含量的顯著增加,推測NaCl和UV-B處理對長葉紅沙黃酮醇類物質積累的促進作用可能是通過調節FLS等類黃酮代謝途徑相關基因的表達實現的。由此可見,FLS基因作為黃酮醇生物合成途徑上的最后一個關鍵基因,其不僅直接決定黃酮醇類物質的生物合成,直接參與二氫黃酮醇向黃酮醇類物質的轉化,同時其表達模式和表達量還與植物的生長發育時期及鹽分、紫外線及水楊酸等多種植物生長調節劑的作用密切相關,因此明確FLS基因對外源環境條件的應答反應及機制對于更好地調控黃酮醇類物質的生物合成至關重要。

2 問題與展望

黃酮醇作為與植物色澤、口感和風味形成密切相關的次生代謝產物,同時作為與人體健康密切相關的功能活性因子,是決定植物及植物源食品營養及外觀品質的重要類黃酮化合物。因此推進植物黃酮醇類化合物生物合成關鍵基因的研究,對于有效促進植物黃酮醇類化合物的積累及調控,有效提高植物及植物源食品的品質具有重要意義。雖然目前有關苯丙烷類代謝途徑及類黃酮代謝途徑的研究較多,其相關生物合成關鍵基因的研究也備受關注,但大部分研究均側重于木質素或花色苷生物合成的研究,而黃酮醇生物合成作為類黃酮生物合成途徑的重要分支,目前有關其關鍵基因的研究尚處于起步階段,有關其關鍵基因對黃酮醇類物質積累的影響及外源環境條件對其關鍵基因的調控作用及機制研究更少,從而極大限制了植物及植物源食品品質的提升。

針對上述問題,后續研究中,應注意打破過分關注花色苷類化合物生物合成的研究格局,而應加強黃酮醇等輔色物質生物合成的研究。而在植物黃酮醇的研究中,應注意打破過分強調植物黃酮醇類物質檢測分析的研究現狀,而應將化合物檢測分析研究與代謝途徑和關鍵基因表達分析研究有機結合,并注重加強外源環境條件與其生物合成關鍵基因表達關系的研究,從而從根本上解決植物黃酮醇積累及代謝調控的有關問題,為植物及植物源食品品質提升奠定基礎。