分心木中化學成分的分離與鑒定

王 丹,董紅敬,楊 鵬,王 曉,耿巖玲,*

(1.山東農業大學食品科學與工程學院,山東泰安 271018;2.齊魯工業大學(山東省科學院),山東省分析測試中心,山東省中藥質量控制技術重點實驗室,山東濟南 250014;3.濟南森康三峰生物工程有限公司,山東濟南 250014)

分心木(DiaphragmajuglandisFructus)為胡桃科植物胡桃(JuglansregiaL.)果核內的干燥木質隔膜,是新疆維吾爾族傳統藥物之一,其特點為味苦、澀,性平,入脾、腎二經。分心木的功效在《本草再新》、《全國中草藥匯編》中均有記載,常用于腎虛[1]、遺精滑瀉、尿頻遺尿、慢性腎功能不全和慢性腎炎[2]等疾病的治療;將分心木與其他藥物配伍,還可以治療失眠多夢、牙齦出血、口腔潰瘍、多汗[3]等。分心木中主要含有揮發油類、酚酸類、黃酮類、蒽醌類、皂苷類等化合物[4-5]。

近年來,有關分心木化學成分系統研究的報道較少,分離鑒定物質成分不全面。藥理活性研究表明:分心木乙醇、正丁醇和水提取物均可不同程度的改善腎陽虛小鼠模型的狀況[6],分心木甲醇、乙醇和石油醚提取液均具有較好的抗菌效能[7],分心木中總皂苷和總黃酮均具有較強的抗氧化活性[8],分心木乙酸乙酯和正丁醇提取物均具有較強的抗腫瘤作用[9]。這些研究主要針對分心木的提取物,藥效物質基礎大多不明確,單體成分有待于進一步研究與開發。此外,在核桃的生產加工中,核桃仁因具有極高的營養價值,產生了大量的分心木;但是目前關于分心木的利用研究較少,造成了資源的大量浪費。因此,為增加核桃副產物的附加值,使資源可持續利用,有必要對分心木化學成分進行系統研究。

本課題組前期已經對分心木的乙酸乙酯部位化學成分進行了系統研究和報道[10],本研究在前期工作基礎上利用現代色譜技術和分離純化方法對分心木的石油醚部位和水部位化學成分進一步深入系統研究,并通過先進的波譜技術對化合物的化學結構進行鑒定解析,為進一步開發利用核桃屬植物資源,深入了解其藥用活性成分奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

分心木 采自安徽亳州藥材市場,經鑒定為胡桃科植物胡桃(JuglansregiaL.)果核內的木質隔膜;甲醇 色譜純,海洋石油化工有限公司;水(HPLC) 娃哈哈飲用水有限公司;95%乙醇 淄博丹陽化工有限公司;石油醚、乙酸乙酯 分析純,濟南禹安化工有限公司;甲酸 色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司。

Waters 2695型高效液相色譜儀 配有YMC-PEAK ODS-A分析型色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)Waters公司;普源L-3000高效液相色譜儀 配有YMC-PEAK ODS-A半制備型色譜柱(250 mm×10.0 mm,5 μm),北京普源精電科技有限公司;Agilent 1200 RRLC-6410 QQQ-MS/MS質譜儀 Agilent公司;INOVA-400型核磁共振波譜儀 Varian公司;R-3型旋轉蒸發器 瑞士Buchi公司;柱色譜硅膠(200～300 目) 青島鼎康硅膠有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗提物的制備 參考文獻[5,11]的提取方法,取分心木9 kg,粉碎,過80目篩,用95%乙醇水溶液80 ℃加熱回流提取2次,每次2 h,料液比1∶4 (w/v),合并提取液并減壓濃縮得乙醇提取物;加水混懸后依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯萃取6次,合并每部分萃取液,分別通過旋轉蒸發儀在真空度60 hPa、水浴溫度55 ℃的條件下減壓濃縮干燥至浸膏狀,得石油醚部位(195.68 g)、乙酸乙酯部位(47.27 g)和水部位(98.21 g),其含水率分別為石油醚部位0.7%、乙酸乙酯部位4.5%和水部位6.5%。

1.2.2 分離純化

1.2.2.1 石油醚部位 取石油醚部位浸膏40 g,經硅膠柱色譜分離,依次用石油醚-乙酸乙酯(10∶0,8∶2,5∶5,2∶8,0∶10)進行梯度洗脫,共得到20個餾分(FS.1～FS.20)。其中FS.7和FS.10分別通過半制備高效液相色譜進行分離,采用甲醇-水(60∶40,V/V)等度洗脫,得到化合物1(10.2 mg)和化合物2(10.4 mg);FS.12通過半制備高效液相色譜進行分離,采用甲醇-水(50∶50,V/V)等度洗脫,得到化合物3(3.3 mg)和化合物4(1.9 mg)。

1.2.2.2 水部位 取水部位浸膏98 g,經MCI柱色譜分離,依次用甲醇-水(5%、30%、60%、80%、100%)進行梯度洗脫,共得到12個餾分(Fr.1～Fr.12)。其中Fr.3(3.33 g)和Fr.4(5.47 g)分別通過反相C18中壓柱色譜進行分離,分別依次用甲醇-水(5%、10%、20%、30%、40%)進行梯度洗脫。Fr.3的5%甲醇洗脫部位(0.26 g)通過半制備高效液相色譜進行分離,采用甲醇-水(18∶82,V/V)等度洗脫,得到化合物5(11.50 mg);Fr.3的30%甲醇洗脫部位(0.15 g)通過半制備高效液相色譜進行分離,采用甲醇-水(35∶65,V/V)等度洗脫得到化合物6(4.5 mg)和化合物7(14.80 mg)。Fr.4的5%甲醇部位(0.10 g)通過半制備高效液相色譜進行分離,采用甲醇-水(10∶90,V/V)等度洗脫,得到化合物8(36.80 mg);Fr.4的20% 甲醇洗脫部位(0.34 g)通過半制備高效液相色譜進行分離,采用甲醇-水(15∶85,V/V)等度洗脫,得到化合物9(11.4 mg)。

1.2.3 結構鑒定 采用質譜儀和核磁共振波譜儀對化合物的結構進行鑒定。質譜條件:離子源:電噴霧離子化源(ESI);模式:正、負離子模式;掃描范圍:m/z為100～1000;噴霧氣壓:30 psi;干燥氣流速:10.0 L/min;干燥氣溫度:350 ℃。核磁條件:根據Varian INOVA-400型核磁共振波譜儀和Varian INOVA-600型核磁共振波譜儀的相應參數設置,以TMS為內標。

1.3 數據處理

質譜數據通過Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis軟件處理,獲得各化合物的分子量信息。核磁共振波譜數據通過MestReNova軟件處理,獲得相應的1H-NMR和13C-NMR信息。

2 結果與分析

化合物1:ESI-MS:m/z219[M+H]+;1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.64(1H,d,J=7.6 Hz,H-8),7.60(1H,d,J=2.0 Hz,H-7),7.26(1H,dd,J=7.6,1.8 Hz,H-6),6.20(1H,s,H-3),4.13(2H,q,J=7.0 Hz,H-1′),1.48(3H,t,J=7.2 Hz,H-2′);13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:191.1(C-4),179.5(C-1),160.7(C-5),160.5(C-2),135.2(C-7),131.3(C-9),124.3(C-6),118.7(C-8),114.0(C-10),109.4(C-3),65.5(C-1′),12.8(C-2′)。該化合物氫譜、碳譜數據與文獻[12]報道的2-乙氧基胡桃醌數據基本一致,故鑒定化合物1為2-乙氧基胡桃醌。

化合物2:ESI-MS:m/z357[M+H]+,355[M-H]-;1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:6.89(1H,d,J=6.4 Hz,H-5),6.87(1H,d,J=6.4 Hz,H-18),6.65(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-19),6.43(1H,d,J=8.0 Hz,H-6),5.55(1H,d,J=2.0 Hz,H-15),2.64(1H,m,H-13a),2.95(1H,m,H-13b),2.31(2H,m,H-12),2.21(2H,m,H-10),1.52(2H,m,H-9),1.81(1H,m,H-8a),1.66(1H,m,H-8b),3.17(1H,m,H-7a),2.36(1H,m,H-7b),3.89(3H,s,2-OCH3),3.81(3H,s,17-OCH3)。13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:211.6(C-11),149.6(C-16),149.4(C-3),146.6(C-1),146.5(C-17),140.7(C-2),134.3(C-14),125.9(C-5),125.7(C-4),121.4(C-19),114.5(C-6),112.9(C-15),112.4(C-18),45.8(C-10),40.6(C-12),29.8(C-7),26.6(C-13),24.0(C-8),18.8(C-9),60.3(2-OCH3),55.5(17-OCH3)。該化合物氫譜、碳譜數據與文獻[13-15]報道的胡桃苷A數據基本一致,故鑒定化合物2為胡桃苷A。

化合物3:ESI-MS:m/z179[M+H]+,201[M+Na]+,分子式為C10H10O3;1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:12.43(1H,s,OH-8),7.52(1H,dd,J=8.4 Hz,7.8 Hz,H-6),7.04(1H,d,J=7.8 Hz,H-5),6.95(1H,d,J=8.4 Hz,H-7),4.94(1H,dd,J=7.8,3.6 Hz,H-4),3.02(1H,m,H-2b),2.67(1H,m,H-2a),2.37(1H,m,H-3b),2.21(1H,m,H-3a);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:204.3(C-1),34.6(C-2),31.2(C-3),67.7(C-4),145.9(C-4a),117.8(C-5),137.0(C-6),117.4(C-7),162.8(C-8),115.3(C-8a)。該化合物氫譜、碳譜數據與文獻[11,16]報道的4,8-二羥基-1-四氫萘醌數據基本一致,故鑒定化合物3為4,8-二羥基-1-四氫萘醌。

化合物4:ESI-MS:m/z209.1[M+H]+,231.1[M+Na]+,417.2[2M-H]+,439.2[2M+Na]+;1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:5.87(1H,s,H-4),2.57(1H,m,H-8a),2.54(1H,m,H-8b),2.39(1H,d,J=17.4 Hz,H-2a),2.18(3H,s,10-CH3),2.07(1H,d,J=17.4 Hz,H-2b),2.03(3H,m,13-CH3),2.00(1H,m,H-7a),1.91(1H,t,J=5.6 Hz,H-6),1.73(1H,m,H-7b),1.08(3H,s,12-CH3),1.04(3H,s,11-CH3)。13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:207.6(C-9),199.1(C-3),164.7(C-5),125.6(CH,C-4),50.1(CH,C-6),47.0(CH2,C-2),42.5(C-1),36.3(CH2,C-8),30.1(CH3,C-10),28.8(CH3,C-11),27.3(CH3,C-12),24.6(CH2,C-7),23.5(CH3,C-13)。該化合物氫譜、碳譜數據與文獻[17]報道的4-megastigmen-3,9-dione數據基本一致,故鑒定化合物4為4-megastigmen-3,9-dione。

化合物5:ESI-MS:m/z339[M+H]+,361[M+Na]+,399[2M+Na]+;1H-NMR(DMSO-d6,400 Hz)δ:9.99(-OH),7.54(2H,d,J=8.4 Hz,H-2,6),7.51(1H,d,J=15.8 Hz,H-α),6.80(2H,d,J=8.4 Hz,H-3,5),6.33(1H,d,J=15.8 Hz,H-β),5.18(1H,dt,H-3′),4.89(1H,s,C4′-OH),4.88(1H,s,C1′-OH),3.86(1H,m,H-5′),3.55(1H,d,J=3.2 Hz,H-4′),1.92(3H,m,H-2′a,e,6′e),1.74(1H,m,H-6′a)。13C-NMR(DMSO-d6,100 Hz)δ:176.54(-COOH),166.61(C=O),160.09(C-4),144.48(C-α),130.53(C-2,6),125.76(C-1),116.26(C-3,5),115.73(C-β),73.37(C-1′),71.64(C-5′),71.44(C-3′),67.81(C-4′),38.71(C-6′),35.58(C-2′)。該化合物氫譜、碳譜數據與文獻[18]報道的3′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid數據基本一致,故鑒定化合物5為3′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid。

化合物6:ESI-MS:m/z281[M-H]-,分子式為C15H22O5;1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.88(1H,d,J=15.2 Hz,H-4),6.39(1H,d,J=15.2 Hz,H-5),5.68(3H,s,H-2),3.90(1H,m,H-9),3.63(1H,d,J=7.2 Hz,H-12a),3.55(1H,d,J=7.2 Hz,H-12b),1.86(1H,dd,J=13.6,6.8 Hz,H-8a),1.70(1H,dd,J=13.6,6.8 Hz,H-8b),1.61(1H,dd,J=13.2,10.4 Hz,H-10a),1.53(1H,dd,J=13.2,10.4 Hz,H-10b),1.99(3H,s,H-15),1.00(3H,s,H-14),0.80(3H,s,H-13)。13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:167.9(C-1),119.6(C-2),148.7(C-3),130.1(C-4),134.9(C-5),81.9(C-6),86.2(C-7),45.9(C-8),64.3(C-9),44.4(C-10),48.5(C-11),75.8(C-12),16.6(C-13),20.0(C-14),21.2(C-15)。該化合物氫譜、碳譜數據與文獻[19]報道的二氫紅花菜豆酸數據基本一致,故鑒定化合物6為二氫紅花菜豆酸。

化合物7:ESI-MS:m/z339[M+H]+;1H-NMR(DMSO-d6,400 Hz)δ:10.02(-OH),7.55(2H,d,J=8.4 Hz,H-2,6),7.52(1H,d,J=15.8 Hz,H-α),6.80(2H,d,J=8.4 Hz,H-3,5),6.35(1H,d,J=15.8 Hz,H-β),5.45(1H,s,C3′-OH),5.17(1H,dt,H-5′),4.94(1H,s,C4′-OH),4.80(1H,s,C1′-OH),3.80(1H,m,H-3′),3.62(1H,s,H-4′),1.99(3H,m,H-2′a,e,6′e),1.84(1H,m,H-6′a)。13C-NMR(DMSO-d6,100 Hz)δ:174.67(-COOH),166.51(-CO),160.19(C-4),144.62(C-7),130.58(C-2,6),125.69(C-1),116.26(C-3,5),115.55(C-8),73.15(C-1′),70.87(C-5′),70.35(C-3′),68.24(C-4′),38.71(C-6′),35.36(C-2′)。該化合物氫譜、碳譜數據與文獻[18]報道的5′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid數據基本一致,故鑒定化合物7為5′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid。

化合物8:ESI-MS:m/z 353[M+Na]+,分子式為C14H18O9;1H-NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:7.51(1H,dd,J=8.4,2.0 Hz,H-6),7.48(1H,d,J=1.6 Hz,H-2),7.16(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),5.04(1H,d,J=7.2Hz,H-1′),3.81(3H,s,-OCH3),3.45(2H,m,H-6′a,6′b),3.15-3.30(4H,m,H-2′,3′,4′,5′)。13C-NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:167.5(C-7),150.7(C-4),148.9(C-3),124.6(C-1),123.3(C-6),114.8(C-5),113.2(C-2),100.0(C-1′),77.5(C-5′),77.3(C-3′),73.6(C-2′),70.0(C-4′),61.1(C-6′),56.1(-OCH3)。該化合物氫譜、碳譜數據與文獻[20-22]報道的香草酸4-O-β-D-葡萄糖苷數據基本一致,故鑒定化合物8為香草酸4-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物9:ESI-MS:m/z443.1[M-H]-,分子式為C21H32O10;1H-NMR(DMSO-d6,400 Hz)δ:7.89(1H,d,J=15.6 Hz,H-4),6.55(1H,d,J=15.6 Hz,H-5),5.77(1H,s,H-2),5.39(1H,d,J=8.0 Hz,H-1′),3.91(1H,m,H-9),3.64(2H,m,H-6′),3.89(2H,m,H-12),3.46(1H,d,J=5.6 Hz,H-5′),3.43(1H,d,J=5.6 Hz,H-3′),3.25(1H,d,J=8.8 Hz,H-2′),3.21(1H,d,J=7.6Hz,H-4′),3.14(1H,m,H-11),2.08(3H,s,H-15),1.87(1H,m,H-8),1.71(1H,m,H-10),1.62(1H,m,H-8),1.53(1H,m,H-10),1.01(3H,s,H-14),0.81(3H,s,H-13)。13C-NMR(DMSO-d6,100 Hz)δ:164.28(C-1),153.02(C-3),137.30(C-5),129.71(C-4),116.51(C-2),94.33(C-1′),86.24(C-7),82.01(C-6),78.34(C-3′),77.06(C-5′),75.83(C-12),72.87(C-2′),70.01(C-4′),64.32(C-9),61.07(C-6′),48.61(C-11),45.96(C-8),44.38(C-8),21.31(C-15),19.99(C-14),16.54(C-13)。該化合物氫譜、碳譜數據與文獻[23]報道的litchiol A數據基本一致,故鑒定化合物9為litchiol A。

從石油醚部位浸膏分離出的物質(化合物1,2,3,4)多為醌類及其衍生物,極性較小;而乙酸乙酯萃取后的水部位浸膏分離出的物質(化合物5,6,7,8,9)多為羧酸類,極性較大,分離難度大。根據化合物的性質,對石油醚部位浸膏采用堿性硅膠柱色譜洗脫,乙酸乙酯萃取后的水部位浸膏采用MCI和反相C18中壓半制備柱色譜相結合的方法進行分離,但所得化合物純度都不高,需要進一步純化。最終我們采用高效液相色譜制備的方法進行純化,大大減少了醌類和羧酸類化合物的損失。

3 結論

分心木乙醇提取物的石油醚部位浸膏和水部位浸膏,經多種柱色譜分離純化,根據高效液相色譜檢測其純度,得到了9個高純度的化合物,應用質譜和核磁共振波譜闡明其化學結構,分別鑒別為2-乙氧基胡桃醌(1)、胡桃苷A(2)、4,8-二羥基-1-四氫萘醌(3)、4-megastigmen-3,9-dione(4)、3′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid(5)、二氫紅花菜豆酸(6)、5′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid(7)、香草酸4-O-β-D-葡萄糖苷(8)和litchiol A(9),其中化合物4,5,7,8和9為首次從核桃種屬植物中分離得到。分心木的石油醚部位和水部位存在多種醌類和羧酸類化合物,實驗進一步豐富了分心木的化學成分,為下一步的藥理活性研究奠定基礎,對于深入了解該種藥用植物的活性成分與藥用價值具有重要意義。