14-3-3η蛋白的生物信息學(xué)分析及原核表達

安冬潔，魏調(diào)霞，高春辰，曹秀麗，趙俊龍，秦鴻雁

(空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部遺傳學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教研室，西安 710032)

14-3-3蛋白是一類廣泛表達的酸性調(diào)控蛋白家族，其在哺乳動物中存在7種亞型(β，ε，η，γ，τ，ζ和σ)[1]，且不同亞型間氨基酸順序具有高度的一致性和保守性[2]。14-3-3蛋白通常以同源或異源二聚體和靶蛋白通過特定的磷酸化基序相互作用[3]，通過改變靶蛋白細胞亞定位、 磷酸化狀態(tài)和活化狀態(tài)來參與許多重要的生命過程[2]，包括轉(zhuǎn)錄翻譯、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白運輸、細胞周期和細胞凋亡等[4,5]。

單核巨噬細胞分布在體內(nèi)各組織器官當(dāng)中，在天然免疫、系統(tǒng)代謝、血管生成、惡性腫瘤中具有重要的調(diào)控作用[6]。不同的微環(huán)境信號刺激下，巨噬細胞可以發(fā)生表型和功能的改變，分為經(jīng)典活化的M1型巨噬細胞和替代活化的M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞高表達腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-1等促炎因子，具有抗菌抗腫瘤的作用；M2型巨噬細胞則高表達精氨酸酶1(arginase 1)、類幾丁質(zhì)酶3樣分子3(chitinase 3-like 3，Ym1)、IL-10、甘露糖受體(Mrcl)等，具有抗炎促腫瘤和促進組織修復(fù)的功能[7]。研究表明，14-3-3對巨噬細胞功能的活化和生存起著重要的作用，已報道的亞型主要有14-3-3ζ、14-3-3β和14-3-3ε。在炎性細胞因子干擾素-γ(interferon-γ,INF-γ)的刺激下，14-3-3ζ通過調(diào)節(jié)coronin 1蛋白亞細胞定位來調(diào)控巨噬細胞吞噬功能[8]。上皮性卵巢癌及阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)中相關(guān)巨噬細胞14-3-3ζ和14-3-3ε表達異常升高[9,10]，提示14-3-3可能通過改變巨噬細胞的功能參與調(diào)控疾病的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)[11]，14-3-3η亞型在脂肪組織巨噬細胞M2型極化中扮演重要角色，但是其具體分子機制尚不明確。

本研究在探究不同極化類型巨噬細胞中14-3-3η mRNA表達水平差異的基礎(chǔ)上，對其進行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建小鼠14-3-3η基因的原核表達載體后誘導(dǎo)表達，得到含有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)標(biāo)簽的14-3-3η蛋白，為今后研究14-3-3蛋白對巨噬細胞功能的作用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達載體pGEX-4T-3、大腸桿菌DH5α和BL21菌株(空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部遺傳學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教研室)；胰化蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉(Oxoid公司)；14-3-3抗體(Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG(博士德公司)；rTaq酶、限制性內(nèi)切酶、連接酶、DNA marker、蛋白預(yù)染maker、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒(TaKaRa公司)；HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qRT-PCR和ChamQTMSYBR@qPCR Master Mix(Vazyme公司)；GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG;科昊生物)。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 野生型C57BL/6小鼠骨髓原代巨噬細胞中加入TRIzol，靜置5 min后加入氯仿震蕩離心，上清加入異丙醇沉淀RNA，用75%乙醇洗2遍RNA，干燥后加入RNase free ddH2O溶解，定量。

1.2.2 qRT-PCR 每個樣品取1000 ng RNA反轉(zhuǎn)錄，總體系20 μl，4 μl反轉(zhuǎn)錄Mix，剩余體積用RNaes free ddH2O補平。反應(yīng)條件為37℃ 30 min，85℃ 15 s。以其作模板進行qRT-RCR(ABI 7500)，反應(yīng)條件：95℃ 30 s，96℃ 5 s，60℃ 34 s，β-actin作為內(nèi)參基因，其中14-3-3η上游引物序列為5’-ACCATGGCAGATGGGAATGAG-3’，下游引物序列為5’-GGTAGCGGTAGTAATCGCCC-3’；β-actin上游引物序列為5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’，下游引物序列為5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’。

1.2.3 pGEX-4T-3-14-3-3η的構(gòu)建 根據(jù)小鼠14-3-3η基因編碼區(qū)序列設(shè)計擴增引物，上下游引物分別加入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點，上游引物：5’-CGGAATTCAATGGGGGATCGAGAGCAGCT-3’，下游引物：5’-GCGTCGACTCAGTTGCCTTCTCCTGCTTCTT-3’；以小鼠原代巨噬細胞cDNA為模板進行擴增，PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增好的14-3-3η基因進行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收PCR產(chǎn)物后用EcoRⅠ和SalⅠ 雙酶切，連接pGEX-4T-3載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，37℃培養(yǎng)過夜挑取單克隆，37℃搖菌16 h，提取質(zhì)粒，進行酶切鑒定和測序。

1.2.4 原核表達載體pGEX-4T-3-14-3-3η的小量誘導(dǎo)表達 測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，挑取單克隆37℃搖菌過夜，次日以1∶100的比例轉(zhuǎn)接到4 ml LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)到菌液A600 nm達到0.6～1.0時加入IPTG誘導(dǎo)表達，37℃ 5 h。 收集菌液，經(jīng)SDS-PAGE考馬斯亮藍染色法檢測。

1.2.5 GST-14-3-3η 蛋白的純化 按照1∶100的比例接種菌液到100 ml培養(yǎng)液中，37℃常規(guī)培養(yǎng)至菌液A600 nm值達到0.6～1.0，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達5 h。收集菌液至離心管中，離心收集沉淀。加入裂解緩沖液重懸菌體，冰上超聲裂解，收集上清，加入GST-tag Purification Resin，4℃孵育60 min，將混合物裝入親和層析空柱管中，洗柱5次后洗脫目的蛋白，二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)法對純化蛋白進行定量后，用SDS-PAGE考馬斯亮藍染色進行鑒定。

1.2.6 融合蛋白Western blotting分析 取15 μg融合蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，恒流170 mA轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)2 h，脫脂牛奶封閉2 h，一抗為兔源14-3-3抗體，4℃孵育過夜，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體，37℃孵育1 h后，使用3，3-二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)發(fā)光顯色，觀察目的條帶。

1.2.7 14-3-3η蛋白的生物信息學(xué)分析 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測：ProtParam tool(http：//web.expasy.org/protparam/)；二級結(jié)構(gòu)預(yù)測：SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)；疏水性分析由ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)軟件完成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 qRT-PCR檢測14-3-3η在原代巨噬細胞不同極化狀態(tài)下mRNA表達水平

培養(yǎng)野生型C57BL/6小鼠骨髓原代巨噬細胞，

脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)和INF-γ誘導(dǎo)M1型極化，IL-4誘導(dǎo)M2型極化。提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后用qRT-PCR檢測14-3-3η表達水平。結(jié)果表明：14-3-3η在M1型巨噬細胞中表達量降低，在M2型巨噬細胞中表達量升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；圖1)，提示14-3-3η可能對巨噬細胞極化起作用。

圖1 14-3-3η mRNA的表達

Compared with control,*P<0.05,**P<0.01; compared with M1,##P<0.01

2.2 14-3-3η蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用SOPMA對14-3-3η蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，α-螺旋占62.60%，無規(guī)則卷曲占29.27%，另外有11.38%的延伸鏈和5.69%的β轉(zhuǎn)角，其中α-螺旋對蛋白質(zhì)骨架具有穩(wěn)定作用，無規(guī)則卷曲決定了蛋白質(zhì)的功能，表明14-3-3η蛋白結(jié)構(gòu)具有較高的穩(wěn)定性(圖2)。

2.3 14-3-3η蛋白理化性質(zhì)分析

使用ProtParam tool分析14-3-3η蛋白序列，分子量為28.2 ku，理論等電點為4.81，其中酸性氨基酸總數(shù)(天冬氨酸+谷氨酸)為45個，堿性氨基酸總數(shù)(精氨酸+賴氨酸)為32個。用ProtScale程序?qū)?4-3-3η蛋白進行疏水性分析，縱坐標(biāo)0之上為疏水區(qū)，0之下為親水區(qū)，可知14-3-3η第100位氨基酸的疏水系數(shù)最高(1.900)；第237位氨基酸的疏水系數(shù)最低(-2.600)。疏水性氨基酸在肽鏈中均勻分布，14-3-3η蛋白的疏水系數(shù)為-0.607，疏水性較差。一般疏水性較強的分子原核表達時易形成包涵體，此時需采用促進目的蛋白可溶性表達菌株，而14-3-3η疏水性較差，因此我們采用GST可溶標(biāo)簽載體構(gòu)建14-3-3η原核表達載體，并選用大腸桿菌BL21菌株進行原核表達。

圖2 14-3-3η蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖3 14-3-3蛋白的疏水性分析

2.4 14-3-3η基因的擴增

以小鼠骨髓來源巨噬細胞cDNA為模板擴增目的序列，特異性擴增出14-3-3η(744 bp)，與預(yù)期片段大小一致(圖4)。

圖4 目的基因14-3-3η的PCR擴增

2.5 重組質(zhì)粒pGEX-4T-3-14-3-3η的構(gòu)建及鑒定

將擴增出的目的片段與pGEX-4T-3空載體經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后挑取單克隆搖菌，提取質(zhì)粒。pGEX-4T-3-14-3-3η質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ 雙酶切后，可見744 bp條帶，符合目的片段大小(圖5)。測序結(jié)果經(jīng)比對后同14-3-3η序列一致，提示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖6)。

圖5 重組載體pGEX-4T-3-14-3-3η雙酶切鑒定結(jié)果

2.6 重組表達質(zhì)粒pGEX-4T-3-14-3-3η的誘導(dǎo)表達

將pGEX-4T-3-14-3-3η重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21菌株中，37℃過夜培養(yǎng)后挑取單克隆活化菌液。首先摸索誘導(dǎo)表達時最佳IPTG濃度，當(dāng)菌液A600 nm值達到0.6時加入不同終濃度IPTG誘導(dǎo)融合蛋白GST-14-3-3η的表達，融合蛋白預(yù)期大小約55 ku。選取最佳IPTG濃度，再用不同溫度和不同時間誘導(dǎo)融合蛋白GST-14-3-3η的表達，使融合蛋白盡量表達在細菌裂解液上清液里，收集菌液，裂解后經(jīng)SDS-PAGE考馬斯亮藍染色法檢測，結(jié)果表明可溶性融合蛋白最佳表達條件為IPTG濃度0.1 mmol/L，25℃誘導(dǎo)表達16 h(圖7)。

2.7 可溶性融合蛋白GST-14-3-3η的純化

IPTG誘導(dǎo)表達后的菌液經(jīng)超聲裂解，離心后收集上清，按照GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒操作步驟對融合蛋白GST-14-3-3η進行純化。純化蛋白用BCA法進行蛋白定量，蛋白濃度為6 mg/ml，行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色和Western blotting(使用14-3-3抗體)鑒定結(jié)果顯示GST-14-3-3η融合蛋白得到了較高效的純化(圖8)。

3 討 論

組織定居巨噬細胞在組織穩(wěn)態(tài)維持、疾病損傷修復(fù)方面起著關(guān)鍵的作用[12,13]。在不同的細胞因子刺激下，巨噬細胞可以發(fā)生表型和功能的轉(zhuǎn)變，其中M1型巨噬細胞由Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)配體蛋白、INF-γ活化，M2型巨噬細胞由IL-4、IL-13、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等誘導(dǎo)活化，分別調(diào)控TH1和TH2型免疫應(yīng)答[7]。巨噬細胞的極化則依賴于體內(nèi)多種信號通路及信號分子在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯后水平的調(diào)控[14]。

圖6 pGEX-4T-3-14-3-3η部分測序結(jié)果

圖7 GST和GST-14-3-3η融合蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達

A: lysis of whole bacteria solution (1: empty vector; 2: empty vector induced by 0.5 mmol/L IPTG; 3: GST-14-3-3η; 4-8: GST-14-3-3η induced by 0.1, 0.2, 0.5, 0.8, 1.0 mmol/L IPTG respectively); B: supernatant of bacteria lysis (1-5: expression induction under the condition of 16℃ 16 h, 20℃ 16 h, 25℃ 16 h, 30℃ 16 h, 37℃ 5 h respectively). M: protein marker; GST: glutathione S-transferase; IPTG: isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

圖8 GST-14-3-3η蛋白的純化

14-3-3蛋白在細胞內(nèi)可以和蛋白激酶B、叉頭族轉(zhuǎn)錄因子O等超過200種分子相互作用[15]，主要依賴靶蛋白上2種特定的14-3-3結(jié)合基序：RSXpS/TXP和RXXXpSXP(pS為磷酸化的絲氨酸，X為任意氨基酸)[1]。由于14-3-3靶蛋白的多樣性，14-3-3蛋白在細胞周期、細胞分化、生存、凋亡、遷移當(dāng)中都起著重要作用[16]。研究表明，外泌體中的14-3-3η通過與細胞膜上配體氨肽酶N(aminopeptidase N，APN)相互作用可以促進單核巨噬細胞IL-1β、IL-6、TNF-α炎性因子的表達，并且促進基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)MMP-1和MMP-9的表達[17]。但是，巨噬細胞本身的14-3-3η對巨噬細胞表型和功能的調(diào)控機制尚未知。

本研究分析了14-3-3η亞型在骨髓來源原代巨噬細胞不同極化狀態(tài)下mRNA表達水平差異，發(fā)現(xiàn)14-3-3η在M1型巨噬細胞中表達較低，M2型巨噬細胞中表達較高，據(jù)此推測14-3-3η可能參與巨噬細胞的極化。為了進一步探究14-3-3η參與巨噬細胞活化的分子機制，我們擬原核表達GST-14-3-3η蛋白。首先對14-3-3η蛋白氨基酸序列進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其二級結(jié)構(gòu)中主要為α-螺旋，說明其結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，并且疏水性較差，推測GST-14-3-3融合蛋白可溶性好，因此選用BL21常規(guī)菌株進行原核表達。其后構(gòu)建pGEX-4T-3-14-3-3η融合表達載體，成功表達并純化出較高純度的GST-14-3-3融合蛋白，為后續(xù)在巨噬細胞中使用GST-pull-down實驗手段研究14-3-3相互作用分子以及其在巨噬細胞活化和生存上的生物學(xué)功能奠定實驗基礎(chǔ)。

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