結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在泌尿系結(jié)核中的診斷價(jià)值

陳 禹* 李桂琴 劉旭暉 付 亮 陳國(guó)璽

（1 沈陽(yáng)市第十人民醫(yī)院 沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng)110044；2 上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508；3 武漢市肺科醫(yī)院，湖北 武漢 430000；4 深圳市第三人民醫(yī)院，廣東 深圳 518040）

泌尿系結(jié)核 (urinary tuberculosis，UTB) 占肺外結(jié)核的30%～40%[1]，是肺外結(jié)核中較為嚴(yán)重的臨床類型。UTB起病隱匿，表現(xiàn)具有多態(tài)性，可呈午后低熱、腰部疼痛、乏力、尿頻、尿急、尿痛等，因通常在疾病的晚期出現(xiàn)癥狀，常導(dǎo)致診斷的延誤，進(jìn)而引起泌尿系統(tǒng)器官的逐漸損毀，也有報(bào)道以腎功能衰竭作為首發(fā)臨床表現(xiàn)的UTB患者[2]。UTB的病理?yè)p壞過(guò)程，突出了進(jìn)行早期、快速診斷的重要性。目前，細(xì)菌學(xué)檢查為結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但因UTB患者的尿液標(biāo)本細(xì)菌含量少，傳統(tǒng)涂片鏡檢抗酸染色陽(yáng)性率低，且不能鑒別非結(jié)核分枝桿菌感染，假陽(yáng)性率較高，結(jié)果往往不可靠；UTB患者的尿液標(biāo)本分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性率低、所需時(shí)間長(zhǎng)，不能滿足臨床早期、快速診治的需要；分子生物學(xué)技術(shù)簡(jiǎn)便、快速，但其敏感度也相對(duì)較低，對(duì)泌尿系結(jié)核的診斷存在局限性，不能滿足臨床需求；通過(guò)膀胱鏡活檢取病理檢查或腎臟切除手術(shù)后病理檢查需要一定的臨床適應(yīng)證，且為有創(chuàng)性檢查，不能作為常規(guī)應(yīng)用，因此迫切需要一種免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)以提高泌尿系結(jié)核的診斷敏感度。目前，臨床上應(yīng)用由ELISPOT技術(shù)發(fā)展而來(lái)的結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌感染的早期診斷，此方法使用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），通過(guò)細(xì)胞因子γ干擾素（INF-γ）的分泌檢測(cè)抗原特異性T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)，從而判斷結(jié)核分枝桿菌感染的狀態(tài)，具有較高的敏感度和特異度[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)患者外周血進(jìn)行T-SPOT.TB 檢測(cè)，并與尿液涂片抗酸桿菌檢測(cè)、MGIT960分枝桿菌培養(yǎng)、Xpert檢測(cè)3種檢測(cè)方法比較，探討其在泌尿系結(jié)核診斷及鑒別診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值，從而提高泌尿系結(jié)核早期診斷水平。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象：2016年2月至2017年2月在沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院、上海市公共衛(wèi)生臨床中心、武漢市肺科醫(yī)院、深圳市第三人民醫(yī)院等4家醫(yī)院連續(xù)納入臨床疑似UTB患者122例。在所有納入患者中，3例被剔除，其中2例為HIV感染，1例為非結(jié)核分枝桿菌感染，最終進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的樣本數(shù)量為119例患者。119例患者入組條件為具有尿頻、尿急、尿痛、血尿、腰痛等臨床癥狀或尿常規(guī)檢查異常患者。所有患者臨床資料完整，取樣前均簽署知情同意書，HIV檢測(cè)陰性，未接受抗結(jié)核藥物治療或抗結(jié)核藥物治療＜1個(gè)月、未進(jìn)行泌尿系手術(shù)治療。

結(jié)核病組：臨床診斷的UTB患者的診斷依據(jù)為：BACTEC MGIT960分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性；典型的臨床表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室尿常規(guī)、結(jié)核菌素試驗(yàn)等相關(guān)檢查；泌尿系影像學(xué)檢查；膀胱鏡活檢，以及對(duì)抗結(jié)核藥物治療反應(yīng)良好等。

對(duì)照組：患者沒(méi)有細(xì)菌學(xué)等其他結(jié)核方面證據(jù)、并且抗結(jié)核藥物治療無(wú)效者則診斷為非泌尿系結(jié)核病。對(duì)照組患者要求既往均無(wú)結(jié)核病病史和結(jié)核病接觸史、無(wú)合并活動(dòng)性肺結(jié)核或影像學(xué)未顯示陳舊性結(jié)核病變，腫瘤患者未經(jīng)過(guò)放療、化療和手術(shù)治療，未接受免疫抑制劑和增強(qiáng)劑治療。

本研究過(guò)程經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核，所有研究對(duì)象對(duì)臨床診斷過(guò)程知情同意。患者的人口學(xué)信息及臨床特征（如年齡、性別、病史、泌尿系統(tǒng)器官累及的范圍及病變形式）等內(nèi)容均來(lái)源于臨床原始病史記錄。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

1.2.1 T-SPOT.TB檢測(cè)：采用T-SPOT.TB試劑盒（牛津Immunotec公司產(chǎn)品，英國(guó)）檢測(cè)分泌IFN-γ的T細(xì)胞，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。抽取患者外周血4～5 mL，將抗凝液和血液混勻待用；放置室溫于4 h內(nèi)進(jìn)行PBMCs的分離，用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMCs，配制細(xì)胞濃度為2.5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液至少300 μL待用。每份待測(cè)樣本需要4個(gè)檢測(cè)孔：空白對(duì)照孔、檢測(cè)孔A（抗原A）和檢測(cè)孔B（抗原B）、陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照[植物血凝素（phytohaemag-glutinin，PHA）對(duì)照]，在各反應(yīng)孔內(nèi)加入下列試劑：加入50 μL細(xì)胞培養(yǎng)液至每個(gè)空白對(duì)照孔內(nèi)；加入50 μL抗原A溶液至每個(gè)必要的檢測(cè)孔內(nèi)；加入50 μL抗原B溶液至每個(gè)必要的檢測(cè)孔內(nèi)；加入50 μL陽(yáng)性質(zhì)控至每個(gè)細(xì)胞功能控制孔內(nèi)；然后每孔加入100 μL配制好的濃度為2.5×106個(gè)/mL的PBMCs懸液，將反應(yīng)板放入濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)18～20 h，棄培養(yǎng)上清液，每個(gè)反應(yīng)孔用200 μL PBS緩沖液清洗4次，在每個(gè)孔中加入50 μL標(biāo)記抗體工作液，2～8 ℃孵育1 h，棄去液體，每孔用200 μL PBS緩沖液清洗4次，每孔加入50μL底物顯色溶液室溫孵育7 min，用蒸溜水或去離子水沖洗終止反應(yīng)，將板放入37 ℃烘箱干燥或者室溫干燥，記數(shù)著色的斑點(diǎn)，每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞。根據(jù)檢測(cè)孔的反應(yīng)判斷結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果為“陽(yáng)性”，參照以下標(biāo)準(zhǔn)：①空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)時(shí)且（抗原A或抗原B孔斑點(diǎn)數(shù)）-（空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)）≥6；②空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為6～10個(gè)時(shí)且（抗原A或抗原B孔斑點(diǎn)數(shù)）≥2×（空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)）。如果上述標(biāo)準(zhǔn)不符合，且陽(yáng)性對(duì)照孔正常時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為“陰性”。

表1 T-SPOT.TB、抗酸桿菌涂片、Xpert、MGIT960液體培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果分析

1.2.2 尿液標(biāo)本涂片查抗酸桿菌：一次性吸管吸取少許無(wú)菌標(biāo)本采集管中的尿標(biāo)本涂于載玻片上進(jìn)行熒光染色（珠海貝索生物有限公司），置光學(xué)顯微鏡下（日本Olympus公司）觀察計(jì)數(shù)，以每50個(gè)視野抗酸桿菌≥3條為陽(yáng)性。

1.2.3 MGIT960分枝桿菌液體培養(yǎng)（美國(guó)BD公司）：取2 mL尿液標(biāo)本用于培養(yǎng)，嚴(yán)格按照MGIT960系統(tǒng)操作說(shuō)明書進(jìn)行前處理，液體培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為42 d。儀器自動(dòng)報(bào)告陽(yáng)性后，取培養(yǎng)液涂片鏡檢，若查到抗酸桿菌則為陽(yáng)性；若未見抗酸桿菌則為陰性。

1.2.4 Xpert檢測(cè)：取1 mL尿液標(biāo)本與標(biāo)配處理液常規(guī)按1∶2比例混合，旋緊管蓋，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩15～30 s，室溫靜置15 min，使標(biāo)本充分液化。吸取2 mL液化的標(biāo)本至Xpert反應(yīng)試劑盒，置于Xpert檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Cepheid 公司）模塊，儀器開始進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)。約2 h反應(yīng)結(jié)束后，在檢測(cè)系統(tǒng)窗口下可直接觀察測(cè)試結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 確診患者情況：119例患者中，59例（49.6%）患者臨床確診為泌尿系統(tǒng)結(jié)核，其中25例（21.0%）MGIT960分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性；34例（28.5%）以膀胱鏡活檢病理、泌尿系影像學(xué)表現(xiàn)、典型臨床表現(xiàn)及對(duì)抗結(jié)核藥物治療有效等為診斷依據(jù)。60例（50.4%）患者臨床診斷為非結(jié)核病患者。

2.2 T-SPOT.TB診斷泌尿系結(jié)核的敏感度和特異度：以臨床診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)，外周血T-SPOT.TB檢測(cè)，尿液涂片抗酸桿菌檢測(cè)、MGIT960分枝桿菌培養(yǎng)、Xpert檢測(cè)的敏感度分別為86.4%（51/59）、11.9%（7/59）、42.4%（25/59）和64.4%（38/59）；特異度分別為75.0%（45/60）、95.0（57/60）、100.0%（60/60）、100.0%（60/60）。涂片、培養(yǎng)、Xpert檢測(cè)均陰性而臨床診斷為泌尿系結(jié)核的患者血T-SPOT.TB檢測(cè)的陽(yáng)性率為81.3%（26/32）。見表1。

2.3 UTB患者的一般情況和臨床特征：進(jìn)一步分析UTB患者的一般情況及臨床特征。本研究顯示，UTB在各年齡段均有發(fā)病，但以中老年男性患者居多。UTB患者的病程較長(zhǎng)，病程1.5個(gè)～3年。UTB患者主要表現(xiàn)為尿頻、尿急、夜尿增多及腰痛等癥狀；可出現(xiàn)酸性尿及無(wú)菌膿尿，易伴有嚴(yán)重的腎臟破環(huán)；并發(fā)腎盂積液，輸尿管增厚、狹窄或擴(kuò)張及膀胱攣縮相關(guān)的尿路梗阻。

3 討 論

UTB起病隱匿，是肺外結(jié)核中較為嚴(yán)重的一種臨床類型，通常在疾病的晚期出現(xiàn)癥狀，因此常導(dǎo)致診斷的延誤及泌尿系統(tǒng)器官的逐漸損毀。考慮到傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)方法耗時(shí)長(zhǎng)，陽(yáng)性率低，操作復(fù)雜等諸多缺點(diǎn)，臨床上迫切需要一種能早期、快速發(fā)現(xiàn)泌尿系結(jié)核且敏感度及特異度均較高的診斷技術(shù)。

T-SPOT.TB檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)越性以及對(duì)泌尿系結(jié)核診斷的應(yīng)用價(jià)值：以T細(xì)胞免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)的T-SPOT.TB檢測(cè)技術(shù)作為一種新的結(jié)核分枝桿菌感染的快速診斷工具被廣泛應(yīng)用于臨床，具有較高的敏感度和特異度，即使在免疫力低下的人群中，T-SPOT.TB依然能夠維持較高的敏感度[5]。由于兩種特異性結(jié)核分枝桿菌刺激原ESAT-6和CFP-10的使用，使得此方法的敏感度和特異度大幅度增加，目前已成為歐美國(guó)家檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的臨床常規(guī)方法之一。本研究中T-SPOT.TB檢測(cè)泌尿系結(jié)核的敏感度為86.4%（51/59），特異度為75.0%（45/60），且在涂片、培養(yǎng)、Xpert檢測(cè)均陰性而臨床診斷為泌尿系結(jié)核的患者中血T-SPOT.TB檢測(cè)的陽(yáng)性率為81.3%（26/32），充分彌補(bǔ)了泌尿系結(jié)核病原學(xué)檢測(cè)敏感度低的不足。此結(jié)果提示以結(jié)核分枝桿菌RDI區(qū)編碼蛋白ESAT-6和CFP-10為抗原的T-SPOT.TB檢測(cè)在泌尿系結(jié)核中有一定的診斷價(jià)值。

綜上所述，由于臨床表現(xiàn)的多樣化和不典型性，UTB患者的診斷十分困難。對(duì)于可疑患者應(yīng)盡早進(jìn)行T-SPOT.TB檢測(cè)，更早更多的獲得結(jié)核病診斷依據(jù)及有效的進(jìn)行鑒別診斷，在結(jié)核病的高發(fā)地區(qū)尤為重要。是早期診斷UTB患者、避免腎功能減損及手術(shù)治療的關(guān)鍵。此外，T-SPOT.TB檢測(cè)也有極少的假陽(yáng)性和假陰性比例，出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因可能是患者曾經(jīng)有過(guò)結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染，出現(xiàn)假陰性的原因可能是標(biāo)本在細(xì)胞免疫發(fā)生前獲取，或者少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不健全，因此當(dāng)其值接近臨界值時(shí).應(yīng)慎重參考，結(jié)合臨床表現(xiàn)及其他輔助檢查進(jìn)一步明確診斷。

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