應用實時熒光PCR檢測不同時期艾滋病患者腸道菌群量的變化及意義

王麗娜 吳翠松 陳薇薇

（江蘇大學附屬鎮江三院艾滋病科，江蘇 鎮江 212005）

艾滋病（AIDS）是一種獲得性免疫缺陷綜合征，因較高傳染性和不可治愈性引起極高的關注。艾滋病患者會出現的各種嚴重并發癥及腫瘤，預后極差，使其成為嚴重威脅我國人民的公共衛生問題。目前已經影響到了國民經濟發展和全社會穩定[1]。本實驗采用實時熒光PCR（real-time fluorescener）方法將艾滋病患者與正常對照者糞便中的五種細菌進行定量檢測，與正常對照組進行比較，分析腸道菌群變化的差異，為臨床診療進行治療提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 觀察組：2010年1月至2016 年1月鎮江市第三人民醫院診治的急性感染期、無癥狀期、艾滋病期患者大便標本各10份，共30例，男性22例，女性8例，年齡19～56歲，平均年齡 （36.05±8.93）歲，糞便采樣前4周內未使用抗生素或微生態制劑；其C淋巴細胞數在（0～676）×106/L，并且無慢性腹瀉癥狀。

1.1.2 對照組：正常對照組30例，男性例22，女性8例，年齡18～54歲，平均年齡 （33.13±8.73）歲。來源于觀察組的配偶或工友共30例。均無胃腸道疾病史，留取糞便標本前4周內未使用微生態制劑或/和抗菌藥物。

1.2 研究材料

1.2.1 引物設計根據細菌的ddl基因序列設計糞腸球菌及屎腸球菌的特異性引物；根據細菌的16SrRNA基因序列設計雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬和大腸桿菌的特異性引物。

1.2.2 實驗試劑細菌基因組DNA提取試劑盒、熒光染料等。

1.2.3 主要儀器 PCR擴增儀、電泳儀等。

1.3 方法：留取自然排便的新鮮糞便，取回實驗室，用天平秤取每份100 mg，按實驗要求處理后，按細菌基因組DNA提取試劑盒提供的說明提取正常對照組及艾滋病患者的糞便細菌DNA[2]。

1.3.1 依據正常對照者糞便基因組DNA來制作五種菌群的標準曲線，應用PCR方法對細菌引物進行特異性擴增，將得到的擴增產物按DNA純化試劑盒說明進行純化，測定純化產物A值及濃度，依據實驗結果制作標準曲線。

1.3.2 將待測糞便樣品中提取的DNA分別進行5種細菌的實時熒光定量PCR檢測，根據反應溶解曲線分析產物的特異性，并對結果進行定量分析。

1.4 統計學方法：實驗數據采用SPSS17.0統計學軟件進行分析，兩組間一致性檢驗用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 用擴增曲線來表示不同拷貝數的模板循環數與熒光強度關系，二者關系呈S形，分為基數期、對數期及平臺期3個階段。其中對數期是熒光信號指數擴增階段，細菌的定量分析在這個階段進行。

2.2 以對數轉換后的拷貝數為橫坐標，以循環數為縱坐標，繪制標準曲線，作為待測樣品的定量檢測的參照標準。

2.3 通過溶解曲線反向驗證引物的特異性，以上5種細菌的溶解曲線均為單峰，說明擴增產物單一。

2.4 糞便細菌定量檢測結果：AIDS/HIV患者糞便中的雙歧桿菌屬及乳酸桿菌屬數量顯著少于正常對照組，P＜0.05；而糞腸球菌、大腸桿菌和屎腸球菌的數量則顯著高于正常對照組，P＜0.05。見表1。

3 討 論

腸道是人體內細菌密度最大的部位，腸道內正常菌群之間互相依賴、制約形成腸道微環境，是人體最重要的微環境。人體絕大部分的淋巴組織及細胞定位于腸道組織內。約40%的總T細胞位于腸黏膜上皮內。因此腸道成為HIV感染早期病毒復制的靶點[3]，也是CD4

+T細胞遭受破壞的主要部位。故消化道是HIV感染過程中最常發生并發癥的系統之一。雙歧桿菌是專性厭氧菌，占腸道總菌量的99%，具有免疫調節也營養的作用，大腸桿菌、糞腸球菌等兼性厭氧菌占腸道菌群的百分之一，在正常生理狀態下不致病。一旦平衡遭到破壞，微生態失調即可造成感染[4]。幾乎所有AIDS/HIV患者都存在不同程度的免疫缺陷；病毒攻擊腸道中的T細胞，腸壁屏障功能受損，腸道敏感菌被抑制，而未被抑制的條件制致病菌如糞球菌、大腸桿菌等大量繁殖，引起菌群失調；釋放的內毒素移位，促進腸源性感染的發生與發展[5]，引發全身多器官功能衰竭。本實驗通對AIDS/HIV患者腸道內五種細菌的定量，與正常對照組進行比較，結果顯示AIDS/HIV患者糞便中雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬數量顯著下降，而大腸桿菌、糞腸球菌及屎腸球菌數量明顯增多。從而說明AIDS/HIV患者腸黏膜屏障受到攻擊破壞后，腸道內的雙歧桿菌、乳酸菌急劇減少；大腸桿菌、糞腸球菌和屎腸球菌得以大量繁殖，發生細菌移位，導致全身感染，最終不可控制，出現多器官衰竭，同時還有可能導致其他疾病的發生，如卡波西肉瘤、惡性淋巴瘤、子宮頸癌[6]。隨著對AIDS/HIV患者腸道微生態研究的不斷深入，目前已取得了一定的進展，為臨床預防及診治提供了可靠地參考。

表1 糞便標本細菌定量檢測結果（-x±s，n=30）

[1] 中華醫學會感染病學分會艾滋病組.艾滋病診療指南[J].中華傳染病雜志,2011,29(10)：629-640.

[2] 郭世奎,王昆華,龔昆梅,等.結直腸癌患者糞便DNA提取方法的比較[J].云南醫藥,2009,30(5)：520-523.

[3] 張琳萄,夏雪山,鄭永唐.艾滋病獼猴模型的腸道病理學研究進展[J].免疫學雜志,2015,28(3)：265-276.

[4] 吳建軍,曾清,溫廣德.雙歧桿菌四聯活菌治療慢性潰瘍性結腸炎的臨床療效觀察[J].現代消化及介入診療,2010,15(2)：116-117.

[5] Magnotti LJ,Deiteh EA.Burns,bacterial translocation,gutbarrier function,and failure [J].Bum Care Rehabil,2005,26(5)：383-391.

[6] KOIKE M,Masuda A,Ichikawa K,et al.Plasmablastic lasmablastic lymphoma of the duodenal and jejunum[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(7)：4479-4483.