血液循環miRNA在肺癌中作用的研究進展

陳君，徐孝飛

(1 解放軍第一一七醫院，浙江杭州 310000；2 杭州聯科生物技術股份有限公司)

肺癌是發病率和病死率增長最快的癌癥 ，如何精準診斷肺癌成為當前世界亟待解決的難題。液體活檢在癌癥中無創傷性早期診斷和實時監測的作用給癌癥患者帶來了希望。目前，液體活檢能檢測各種循環癌癥生物標志物，如循環腫瘤細胞(CTC)、循環腫瘤DNA、循環miRNA等。miRNAs是一類內源性非編碼的RNA小分子，長度19～25個核苷酸。miRNA首先在核內被RNA聚合酶Ⅱ轉錄合成初級miRNA，再由Drosha-DGCR8加工形成60～100 nt莖環結構前體miRNA，然后被核運輸受體exportin-5和核蛋白Ran-GTP運送至細胞質，由Dicer再進一步加工形成25 nt成熟miRNA[1]。miRNA可通過其靶基因調控下游細胞通路，影響細胞的增殖、轉移、凋亡、耐藥等[2]。循環miRNA可能來源于損傷的組織、凋亡壞死的細胞以及細胞中的微囊泡，它穩定存在于血清、血漿等體液中，在腫瘤疾病患者體內和正常人的表達存在顯著的差異，因此循環miRNA可作為腫瘤預測的生物學標志物。目前，已有很多研究報道，miRNA在血液中檢測可發揮疾病診斷、患者預后評估、治療反饋的功能。

1 血液中循環miRNA的檢測技術

在肺癌中，循環miRNA檢測樣品主要是血漿或血清，由于樣品體積少，miRNA在血清或血漿中含量不高，后續選擇適合的檢測技術尤為重要。McDonald等[3]報道循環miRNA在血漿或血清中比較穩定，但由于紅細胞內也存在大量miRNA，血液樣品不及時處理會受到溶血影響，導致檢測結果精確度不夠，因此選擇參照標準化時，采用外源添加的cel-miRNA-39-3p作為外參。另外，Guo等[4]專門比較了5種血清循環miRNA提取試劑盒(Qiagen Circulating Nucleic Acid Kit，ThermoFisher Scientific Ambion TRIzol LS Reagent，Qiagen miRNEasy，QiaSymphony RNA extraction kit和Exiqon MiRCURY RNA Isolation Kit)提取小RNA的質量，Qiagen Circulating Nucleic Acid Kit獲取的miRNA變異性最佳，但Ambion TRIzol LS Reagent提取獲得的miRNA閱讀數百分比最高，各個提取試劑盒均有優劣。

檢測循環miRNA的常規方法一般有兩種，基因芯片表達譜和PCR檢測。基因芯片表達譜檢測用于高通量篩選差異miRNA，PCR檢測則進一步驗證選定的miRNA是否有效。經實驗比較，對于血液中的miRNAs檢測，基于Q-PCR平臺的芯片(TaqMan ABI，miRCURY Exiqon)敏感性更高，而在血漿中低表達的miRNA，miRCURY的敏感性和準確性優于TaqMan平臺[5]。PCR檢測又細分為Q-PCR和ddPCR，但Q-PCR和ddPCR兩種方法檢測出來的肺癌循環miRNA結果并沒有很大區別[6]。此外，Gao等[7]研發了一種利用硅鈉米線場效應的生物傳感器，可同時檢測miRNA-126和癌胚抗原的表達水平。

2 循環miRNA在肺癌中的診斷價值

肺癌主要分為非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)兩大基本類型，NSCLC又包括鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌。目前，在各類肺癌中都有文獻報道循環miRNA可作為診斷指標。

Shang等[8]發現 miR-22在鱗癌患者血漿中表達高于正常人，miR-126在腺癌患者血漿中表達低于正常人，并且這兩個miRNA預測NSCLC發生的受試者工作特征曲線(ROC)中曲線下面積(AUC)均大于0.8，另外關于NSCLC轉移的ROC中AUC均大于0.7。Wang等[9]選取118例早期肺癌患者，48例中晚期肺癌患者和135例健康人血清進行探針預測miRNA和Q-PCR驗證，發現miR-125a-5p、miR-25和miR-126聯合診斷較為準確，AUC在診斷早期肺癌時已達0.936。因此，多個miRNA作為生物標志物來診斷肺癌發生，靈敏度和特異度高于單個miRNA，有更好的診斷精確性。

miRNA還可以和某些基因或蛋白聯合診斷肺癌發生。Roth等[10]通過35例NSCLC患者和7例良性肺部腫瘤患者以及28例正常人的血清比較，發現NSCLC患者血清中半胱天冬酶活性比正常人高,但又比良性肺部腫瘤患者低，還發現miR-10b、miR-141、miR-155在NSCLC患者血清中含量高于正常人和良性肺部腫瘤患者，AUC均大于0.7。

3 循環miRNA在肺癌中的預后評估價值

Wang等[11]使用全miRNA表達譜芯片測試長生存期(大于24月)NSCLC患者及短生存期(小于6月)患者，分析出140個高表達的miRNA，再通過生物信息學GO分析和miRNA靶基因預測數據庫，篩選出與TGF-β1信號通路相關的35個miRNA，進一步用比例風險回歸模型分析生存期影響因素，得出17個miRNA與2年生存期有明顯關聯。其中miR-16表達在長短生存期中差異最大，長生存期與高表達的miR-16有關。進行風險評分得出，高風險分數患者比低風險分數患者死亡率增加2.5倍，中位生存率減少7.8個月。

Rui等[12]根據SCLC能否安全接受放療條件分組，挑選22例局限期(LD)SCLC和50例廣泛期(ED)SCLC患者血清進行miRNA芯片分析。結果顯示，miR-574-5p等4個miRNA在ED組中高于LD組，而miR-184和miR-4459則是LD組高于ED組。再進一步用45對相應的組織和血清進行驗證，體外驗證選用H446和H2227細胞，得出miR-184通過抑制EPAS1基因從而抑制Wnt/β-catenin通路活性抑制SCLC轉移侵襲，miR-574-5p抑制PTPRU基因激活Wnt/β-catenin通路促進SCLC轉移侵襲。另有研究表明，miR-574-5p在A549、PC-9等NSCLC細胞中同樣具有抑制PTPRU基因激活Wnt/β-catenin通路促進細胞遷移侵襲作用，但是miR-574-5p表達高低在75例患者無進展生存期(PFS)和總生存率(OS)上差異并沒有統計學意義，并不是NSCLC預后因子[13]。SCLC和NSCLC中預后相關miRNA雖然可能具有同樣的生物學功能，但臨床上并不能通用。

4 循環miRNA在肺癌中的治療反饋功能

在放療方面，Sun等[14]通過80例Ⅱ～Ⅲ期接受放療局部晚期NSCLC患者血清miRNA表達譜檢測，篩選出11個miRNA預測放療劑量增減對OS的影響，建立了一種劑量反饋評分(DRS)的算法，可有效預測高劑量和標準劑量治療后患者的OS。低DRS的患者中，高劑量放療與標準劑量放療相比顯著改善OS，且大劑量放療也能降低遠處轉移和局部進展的風險。高DRS患者高劑量放射治療和標準劑量放療在OS上相似。

在化療方面，Li等[15]從60例NSCLC患者和30例正常人的血清miRNA比較中發現,miR-210表達升高可作為NSCLC診斷依據，且根據36例接受2～3次鉑類化療的晚期NSCLC患者的療效反饋分析，穩定和疾病進展組患者比局部緩解組患者血清miR-210表達更高。Shi等[16]重點關注ⅢB期和Ⅳ期肺腺癌患者(無EGFR基因和ALK基因突變)培美曲塞聯合順鉑一線治療后單用培美曲塞維持治療情況，通過76例培美曲塞維持治療組和72例只接受最佳支持治療的觀察組患者血清miRNA譜比較發現，高表達miR-145、低表達miR-25和miR-210的培美曲塞維持治療人群具有較長的PFS。

在靶向藥物方面，Shen等[17]通過60例表皮生長因子受體(EGFR)突變患者和68例EGFR未突變患者血清miRNA表達譜檢測發現,miR-21可作為吉非替尼治療反饋的預測因子，吉非替尼治療后降低了miR-21表達，患者獲得了更長的OS。此外，miR-10b在EGFR突變患者血清中含量高于未突變患者，且在進展期表達高于疾病完全緩解或疾病穩定期，但miR-10b表達與EGFR是否突變沒有相關性。

程序性死亡受體1(PD-1)和程序性死亡受體-配體1(PD-L1)是最近癌癥免疫治療的熱點，目前還未有循環miRNA在PD-1或PD-L1治療前后的臨床血液miRNA監測數據，但有文獻表明，miR-200家族、miR-34NA家族和miR-197在肺癌NSCLC細胞中與PD-L1有一定相關性[18]。

5 展望

目前，關于一些miRNA在血液中各組分中是否有表達已有相關數據庫(http://134.245.63.235/ikmb-tools/bloodmiRs)可查詢，但這些miRNA仍不全面，未能獲知miRNA在肺癌臨床中發揮了何作用。因此，我們仍需進一步試驗歸納，獲得不同肺癌種類的最佳預測、預后、治療反饋功能特殊miRNA，用來作為生物標志物，以達到精準治療的目的。

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