肺癌相關基質金屬蛋白酶研究進展

吳偉東，羅磊，丁鋒

(暨南大學醫學院附屬廣州市紅十字會醫院，廣州 510220)

肺癌是全世界男性和女性癌癥相關死亡的主要原因[1]。從生物和臨床角度來看，肺癌是一種具有多種組織學亞型的異質性疾病，其中非小細胞肺癌(NSCLC)最常見。傳統上，NSCLC已經被用來表示具有不同于小細胞癌(SCLC)的組織學和細胞學特征的腫瘤。大多數NSCLC可以分為三大類：大細胞癌、鱗狀細胞癌及腺癌。然而，還有其他較少診斷的組織學類型。50%以上的典型NSCLC病例被診斷時已是晚期[2]，對于大多數NSCLC患者，化療為其主要治療方法但預后仍然很差[2]?；|金屬蛋白酶(MMPs)在肺癌發病機制中的作用及進一步鑒定相關新型治療靶標可能有助于肺癌患者的早期檢測和生存改善。

1 MMPs的生物學功能

1.1 結構與分類 截至目前，已經鑒定出人類MMP家族成員中23種不同的金屬蛋白酶成分[3]。與MMP-1序列同源性一樣，大多數proMMPs結構中含有半胱氨酸轉化基序PRCGXPD來維持其酶原形式。每種MMPs催化結構域中的鋅結合基序HEXGHXXGXXH決定其結合相關蛋白酶的種類。對于底物與某些MMPs的特異性結合，MMPs具有幾個S亞位，Zn2+的右側激發的S1′、S2′和S3′和Zn2+的左側未激發的S1、S2、S3，以及其催化位點的Zn2+本身。其中，S1′口袋是最關鍵的識別位點，在不同的MMP中S1′口袋所含氨基酸序列和深度不一。對于所有MMP，P1′-S1′相互作用是決定底物切割位置的關鍵因素(P1′是底物與酶的S1′口袋結合的基團)；然而MMP-23除外，因其缺乏半胱氨酸轉換基序，但其催化結構域的氨基酸序列與MMP-1有關。MMP通常由前結構域、催化結構域、鉸鏈區和血紅蛋白結合域四大塊組成。它們從細胞分泌或錨定到質膜?；贛MPs序列相似性、結構域組織差異性和底物特異性，MMPs可分為膠原酶：MMP-1、-8、-13、-18；明膠酶：MMP-2、-9；基質降解酶：MMP-3、-10、-11；膜型MMP：MMP-14、-15、-16、-24、-17、-25；Matrilysins:MMP-7、-26；其他MMPs：MMP-12、-19、-20、-21、-23、-27、-28。

1.2 MMPs活性的調控機制及功能 MMPs的活性調節機制于多個水平嚴格調控，包括基因表達、酶原激活、區室化和活性酶的抑制[4]。大多數MMP的表達在轉錄水平上受各種生理誘發因子包括激素、生長因子、細胞因子、細胞-細胞相互作用、細胞-細胞外基質相互作用及部分相關腫瘤啟動子等調節[5]。proMMPs細胞內激活時需要破壞前結構域中保守的半胱氨酸殘基的硫醇與催化位點中的鋅離子之間的共價鍵，阻斷底物結合裂口。在細胞外活化期間，半胱氨酸轉換可以通過自溶或其他蛋白酶如纖溶酶、胰蛋白酶、弗林蛋白酶和其他MMPs來激活。此外，半胱氨酸轉換可以通過活性氧氧化半胱氨酸或被含汞化合物人為地破壞，導致前結構域的變構重新定位及自溶裂解[6]。另外，MMPs特異性和活性可以通過某些胞內或胞外局部空間位置差異分隔來控制，可能與糖胺聚糖的相互作用有關[7]。激活后的MMPs可分解成一種或多種細胞外基質成分，且不同MMPs之間亦能相互激活。活化后的MMPs，通過蛋白酶抑制劑如α2-巨球蛋白及其特異性抑制劑即金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)直接抑制。MMPs的活性主要受到內源性抑制劑TIMPs直接抑制，該家族由四種作為糖基化或非糖基化形式存在的蛋白酶抑制劑TIMP 1～4組成。TIMP是21～29 kDa的蛋白質，其具有由125個氨基酸組成的N-末端結構域和由65個氨基酸組成的C-末端結構域，兩末端結構域均含3個二硫鍵，其中N末端結構域作為單獨單位折疊并與MMPs的催化結構域之間存在緊密聯系。然而，在某些情況下，C末端結構域可以進一步增強MMP/TIMP相互作用。此外，TIMP可以與明膠酶酶原相互形成復合物，這表明其C-末端結構域與血紅蛋白樣結構域存在相互作用。分泌形成的TIMPs可以與多種膜錨定或分泌的MMP相互作用[8]。以1∶1結合MMP的活性位點形成抑制復合物，并且抑制所有MMP的活性。TIMPs在體內不同組織差異分布反映其基因表達特異性，其被單獨調節。TIMPs中除了TIMP-3與細胞外基質隔離外，其余均以可溶形式存在。在結構上，TIMP由兩個并排的結構域組成，每個域由3個內部二硫鍵穩定化[9]。其N末端為抑制性結構域，有時被稱為“抑制結構域”。然而，Batra等[9]研究發現，除了此兩個抑制結構域單獨作用外，完整TIMP的MMP復合物中，相互抑制作用可增加一個數量級。四種人TIMPs具有廣泛的重疊特異性，且每一種TIMP可抑制大多數MMPs，但相互之間親和力譜跨越多個數量級。其中TIMP-2/MMP-2和TIMP-1/MMP-9的相互作用不僅涉及MMP催化結構域，而且還涉及與類血紅素結構域的相互作用。除了TIMP外，α2-巨球蛋白和受體介導的內吞也可以防止活化的MMPs發揮其作用。體內局部組織中proMMPs、活性MMPs及TIMPs之間的平衡決定了MMPs的整體活動?？刂葡鄳课簧?、病理過程及信號事件，如細胞的生長和分化、細胞遷移與侵襲、細胞成活及凋亡、局部血管生成等。

膠原酶的特征為它們能夠在N端的四分之三的特定位點切割間質膠原Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。膠原酶也可以消化許多其他細胞外基質和非細胞外基質分子。明膠酶的催化結構域含有三個重復的Ⅱ型纖連蛋白結構，其可結合膠原、明膠和層粘連蛋白，降解變性的膠原蛋白和明膠。其中僅MMP-2可降解Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原?；|降解酶可以消化各種基質，如明膠、纖連蛋白、核酸、層粘連蛋白、腱生蛋白、玻連蛋白、核心蛋白聚糖以及蛋白聚糖?；|降解酶中MMP-3、-10具有相似的底物特性，但MMP-3的蛋白水解效率更高。除了降解細胞外基質組分外，MMP-3同時可激活多種proMMPs，其在部分加工的proMMP-1成為完全活性的MMP-1的生化過程中起著至關重要的作用。Matrilysins特征在于缺乏血紅蛋白結合域。MMP-7、MMP-26也被稱為endometase。其中MMP-26具有更多的底物特異性限制。Matrilysins除可降解細胞外基質組分外，MMP-7還可以處理細胞表面分子，如前-防御素、As配體、前腫瘤壞死因子-α和E-鈣黏蛋白。在四種膜型MMP中，MMP-14和-15具有大量重疊的底物特異性，包括天然原纖維膠原、明膠、纖連蛋白和玻連蛋白。其中MMP-17和MMP-25是糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白，可通過GPI錨定點與細胞膜連接進而切割Ⅳ型膠原、明膠、纖連蛋白和層粘連蛋白[10]。膜型基質金屬蛋白酶1(MT1-MMP)在血管生成中起重要作用。MT5-MMP是腦特異性的，主要在小腦中表達。MT6-MMP(MMP-25)僅在外周血白細胞和間變性星形細胞瘤和膠質母細胞瘤中表達，但不在腦膜瘤中表達。其他MMPs中金屬彈性蛋白酶(MMP-12)主要在巨噬細胞表達，是巨噬細胞遷移所必需的。消化朊蛋白酶的Elylysin(MMP-20)主要位于新形成的牙釉質內。缺陷性牙釉質遺傳性疾病，是由于MMP-20切割位點的突變引起的。MMP-23也稱為半胱氨酸陣列MMP，主要在生殖組織中表達。MMP-28，主要在角質形成細胞中表達。完整和損傷的皮膚中的表達模式表明MMP-28可能在組織止血和傷口修復中起作用。MMP-22首先從雞成纖維細胞中發現，這種酶的功能未知。Khokha等[11]發現，MMPs細胞表面受體的胞外域脫落影響細胞膜的表面組成和細胞對胞外信號的反應性。鑒于MMPs的多重效應，可以推測其在不同的生理和病理生理條件下發揮重要作用。

2 與肺癌相關MMPs

2.1 MMP14(MT1-MMP) 在各種膜型基質金屬蛋白酶中，MMP14是惟一一種可以降解膠原Ⅰ的模型MMP,因此在通過細胞外基質的細胞遷移中起著關鍵作用。研究證實，MMP14無效小鼠模型實驗中，小鼠發生異常，于4周后死亡，表明MMP14不可或缺性及不可代替性。多種人類腫瘤中MMP14均存在上調。MMP14通過類血紅素結構域結構域識別水解底物，類血紅素結構域的二聚化顯著增加MMP14的活性，其可切割并激活proMMP2和proMMP13，促進細胞外基質蛋白水解，進一步促進腫瘤細胞遷移、侵襲和轉移擴散。Stawowczyk等[12]研究發現，在原位Kras驅動的NSCLC小鼠模型(K-ras LSL-G12D/+ ; p53 flox/flox)中發現，MMP14在腫瘤內骨髓細胞和EpCam+腫瘤細胞中均上調。定量RT-PCR分析和Western印跡證實在腫瘤內髓系細胞和上皮間隔區MMP14表達增加。肺切片的免疫熒光染色顯示，在腫瘤中的上皮細胞和造血基質細胞中都檢測到膜特異性MMP14表達。在NSCLC患者腫瘤組織中也觀察到MMP-14異常升高，與鄰近非腫瘤組織相比，MMP14在CD11b+、CD33+單核細胞，CD11b+、CD33-中性粒細胞及EpCAM+上皮細胞中特異性上調。用DN-MMP14阻斷MMP14的功能，可能由于其降解膠原蛋白Ⅰ功能受損，致使細胞外基質降解能力減弱，阻斷腫瘤細胞的侵襲過程。小鼠模型中顯示MMP14表達陰性的HKP1肺腫瘤細胞生長受抑制，表明MMP14可能在NSCLC進展中起關鍵作用。后期可以更加深入研究MMP-14在NSCLC中的作用及開發MMP-14抑制劑，改善NSCLC患者的治療效果。

2.2 MMP-10 MMP-10與其他兩種基質降解酶(MMP-3、-11)存在較大差異。雖然MMP-10在結構和底物特異性方面與MMP-3密切相關，但誘導能力、活性和細胞分布迥然不同。MMP-10具有相對寬的底物特異性，包括proMMP、細胞外基質組分、蛋白聚糖、糖蛋白和膠原。與其他幾種MMPs主要位于腫瘤基質不同，主要表達于腫瘤細胞。MMP-10的過表達已經在上皮起源的幾種人類腫瘤中得到證實，包括頭頸部、食管和口腔鱗狀細胞癌以及皮膚鱗狀細胞癌和基底細胞癌。Gill等[13]通過對甲醛固定及石蠟包埋的NSCLC標本、NSCLC新鮮切除標本和組織學正常的早期肺癌癌旁組織分析發現，大多數組織學正常肺組織切片中MMP-10低表達，NSCLC組織學類型中MMP-10呈高水平表達。但不同等級的NSCLC組織MMP-10表達無明顯差異性。在腺癌、大細胞癌和鱗狀細胞癌中MMP-10表達異常升高，但相互之間差異無統計學意義，且與淋巴結轉移無相關性。早期在上皮性皮膚癌研究中發現，僅在層粘連蛋白-5(Ln-5)陽性腫瘤細胞中觀察到MMP-10的表達，且與之前傷口愈合研究一致。表明這兩種蛋白存在緊密聯系。Ln-5在肺腺癌中亦過表達，與血管侵襲、復發和預后不良相關，其過表達發生在肺腫瘤形成相對早期階段，與淋巴管侵襲或轉移無關。假設MMP-10為肺腫瘤形成早期事件，則涉及腫瘤生長而非侵襲，并與預后不良相關聯。一項小型研究(6例病例)證實人類NSCLC手術切除后復發中MMP-10 mRNA水平升高(5例)[14]，提示MMP-10在NSCLC發展中的存在潛在作用?；贛MP-10在人類腫瘤中的表達譜，加上廣泛底物特異性和致瘤過程不同階段的表達差異，表明MMP-10是潛在的腫瘤標志物，或許可預測臨床行為，使特異性抑制劑或靶向治療劑靶向MMP-10治療NSCLC成為一種可能性。

2.3 MMP-2、MMP-9 在MMPs中，MMP-2(明膠酶A)和MMP-9(明膠酶B)在膠原蛋白降解中尤其重要，通過膠原酶裂解原纖維膠原三重螺旋結構使膠原蛋白變性失活。MMP-2、-9對天然Ⅳ型和Ⅴ型膠原蛋白、蛋白聚糖、彈性蛋白和纖連蛋白也具有強活性。研究發現，其在腫瘤侵襲和轉移中發揮重要作用。后期研究發現，生長因子如血管內皮生長因子被隔離在細胞外基質中可以通過MMP-9介導的蛋白水解而激活。MMP-2、-9也可激活一些非矩陣相關底物，如生長因子7、9，細胞因子，趨化因子等。以往在MMP-9缺陷KO小鼠模型中表現出特征性的胚胎表型，其特征在于長骨中生長板的血管化和骨化的延遲。實驗中MMP-9缺陷小鼠中腫瘤細胞轉移能力減弱。Masson等[15]將惡性角質形成細胞移植到MMP-2-/-，MMP-9-/-和雙重MMP-2-/-MMP-9-/-小鼠模型中發現，MMP-2和MMP-9的組合缺乏會損害腫瘤侵襲和血管形成。移植到MMP-2-/-，MMP-9-/-小鼠中的腫瘤細胞招募血管發生,并以野生型小鼠觀察到的相似程度滲入宿主組織。當惡性細胞移植到雙重MMP-2-/-MMP-9-/-小鼠時，宿主衍生的血管不能向腫瘤細胞層遷移，受阻于膠原凝膠層下。Li等[16]研究發現，MMP-2、MMP-13在大細胞肺癌腫瘤血管生成模擬(VM)中具有重要作用。由MMP-2切割的Ln-5片段在三維培養物中通過大細胞肺癌細胞系H460和H661促進管狀結構形成。用MMP-2切割的Ln-5片段處理的細胞高表達表皮生長因子受體(EGFR)和F-肌動蛋白，而MMP-13的瞬時上調或用重組MMP-13蛋白處理在3D培養中消除H460細胞的管狀結構形成；同時由MMP-13切割的Ln-5片段降低EGFR/F-肌動蛋白表達并破壞VM形成。MMP-13與大細胞肺癌組織中的VM、Ln-5和EGFR呈負相關。總之，MMP-2或MMP-13可通過切割Ln-5來影響EGFR信號激活，進而促進或破壞大細胞肺癌中的VM形成。

2.4 MMP-13 膠原酶中的MMP-13可以降解細胞外基質中的原纖維膠原蛋白，其在正常組織中表達極低。最早在乳腺癌中發現,后來在關節炎、動脈粥樣硬化等許多病理狀況下觀察到異常表達。已有研究報道，MMP-13在頭頸部鱗狀細胞癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌及皮膚癌癥中過表達。在頸部鱗狀細胞癌、泌尿道或皮膚癌中觀察到，MMP-13不僅表達于腫瘤細胞本身，在其周圍基質細胞中亦過表達，特別是侵襲前基質中。提示MMP-13可能在介導細胞侵襲所需早期信號事件中發揮重要作用。Mathieu等[17]通過小鼠K-ras LSL-G12D肺癌模型研究MMP-13在整個肺腫瘤發生過程中(AAHs肺異種腺瘤性增生，腺瘤和腺癌)的表達情況。在K-ras LSL-G12D小鼠模型中使用MMP特異性熒光探針和雙重MRI-FMT成像系統檢測，結果顯示活體小鼠肺癌組織中MMPs高表達。同時通過人肺腫瘤分析證實，與非侵入性病變相比，人肺腺癌MMP-13的免疫組織化學染色顯示侵襲性和微創性腺癌中MMP-13表達顯著增加。表明MMP-13在肺腺癌發生中的重要性，提示MMP-13的表達可作為肺腺癌進展的潛在標志物，對后期用于早期診斷的特異熒光智能探針及肺腺癌的治療開辟了新徑。

3 MMPs的人工合成抑制劑

研究顯示,MMPs在各種疾病(特別是腫瘤激活，生長，侵襲過程中)病理生理過程中起關鍵作用。因此MMPs可成為特異治療靶點。TIMPs為MMPs的天然組織抑制劑，有助于維持細胞外基質的動態平衡。然而，由于體內半衰期短，TIMPs不適合藥理學直接應用。迄今為止，大量人工合成MMP抑制劑在實驗模型中顯示出一定效果。在有關肺癌小鼠模型中使用肽模擬/非肽模擬抑制劑后，腫瘤生長及侵襲明顯受抑制，但肌肉、骨骼等毒性作用明顯，且對肺癌晚期小鼠并無效果。但在人類的Ⅲ期臨床試驗中測試的幾代合成的MMP抑制劑，包括肽模擬物(巴馬司他)、非肽模擬抑制劑(BAY12-9566，stationmaster，BMS-275291和CGS27023A)和四環素衍生物，并未取得很好的預期效果。部分原因可能是臨床試驗(比如試驗設計欠佳及臨床終點不足)和藥物本身(如代謝不穩定，口服生物利用度低，抑制特異性差和副作用不良)的問題。在未來研究中或許可以通過使用基因譜及組織微陣列來區分每種MMP的具體作用及位點，通過熒光智能探針體內成像技術評估MMP抑制劑在癌癥進展的治療效果及其活性，使TIMPs成為可行高效的靶向治療途徑。

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