TET1在肝癌組織中的表達及對HepG2細胞生物學行為的影響

王傳旭，劉傳亮，史光軍

(1濰坊醫學院，山東濰坊 261053；2青島大學醫學院;3青島市立醫院)

肝癌是世界范圍內第五大最常見惡性腫瘤，也是癌癥相關性死亡的第二大原因，并且其發病率持續升高。雖然在過去十幾年中，其治療水平有相當大提高，但是肝癌患者的總生存期卻沒有明顯提高[1]。因此，探究肝癌發生發展的分子基礎，尋找建立有效的監控和治療靶點是現今最重要的研究方向。腫瘤生長和癌癥侵襲普遍受表觀遺傳學方式的調控，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA以及染色體結構改變。異常的DNA甲基化被證實參與腫瘤的發生發展以及化療藥物的抵抗[2]。TET家族是一種甲基胞嘧啶加雙氧酶，其中包含TET1、TET2、TET3。TETs可以催化DNA的脫甲基化，主要通過催化5-甲基胞嘧啶(5-mC)轉變成5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)。其中，在癌癥進展中TET1是最主要和研究最多的[3]。有研究發現，TET1促進基因重排相關的惡性腫瘤發生，如MLL型白血病[4]；在胃癌、肺癌中則發揮抑制腫瘤的作用[5]。2017年6月～2018年2月，本研究探討了TET1在肝癌中的表達變化以及在肝癌發病過程中發揮的生物學作用。

1 材料與方法

1.1 材料 組織:肝癌組織及癌旁組織(距離癌組織2 cm)標本切片38例份由濰坊醫學院病理科提供。其中，患者男33例、女5例，年齡44～59歲、平均49.2歲，術前均未行放化療及靶向藥物治療。細胞:人肝癌HepG2細胞株由青島市立醫院肝膽胰細胞實驗室惠贈；試劑及儀器：DMEM培養基、胎牛血清、胰酶、PBS購自Gibico公司；TET1抗體、GAPDH抗體、HRP二抗購自Sigma公司；SDS-凝膠配制試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和PVDF膜購自上海碧云天生物技術有限公司；CCK-8試劑盒購自日本DoJINDO公司；TET1過表達質粒和過表達空載質粒購自南通思特康生物科技有限公司。

1.2 肝癌組織及癌旁組織中TET1蛋白表達的檢測 ①采用免疫組化SP法。組織脫蠟后遞減濃度乙醇復水，PBS洗片，30%過氧化氫溶液孵片10 min，蒸餾水洗3次，然后進行抗原修復，PBS洗片，羊血清室溫封閉30 min，TET1抗體(1∶2 000稀釋)4 ℃孵育過夜。PBS洗片后加入二抗，20 ℃、20 min，PBS洗片，DAB顯色，蘇木精復燃，脫水，中性樹膠封片，鏡檢。TET1蛋白在組織中主要表達在細胞核中，呈棕黃色顆粒。使用Remmele等提出的免疫反應積分評分法對染色后的切片進行評分。根據陽性細胞數和著色深度計分，每例隨機觀察計數5個高倍視野(×400)，計算每個視野的陽性率，取平均數，并按下列計分：陽性細胞≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。著色深度：陰性結果0分，淡黃色染色1分，淡棕色染色2分，棕色染色3分。取兩者乘積作為總分進行分析，≥1為陽性，<1為陰性。②采用蛋白質印跡法：取低溫保存的肝癌及癌旁組織30 mg，用含有蛋白酶抑制劑的裂解液提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度。取等量蛋白樣品(40 μg)進行電泳，并轉移至PVDF膜上。用含有5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，棄去封閉液，分別加入用5% BSA的PBS稀釋的一抗(TET1 1∶200；β-actin 1∶2 000)，4 ℃搖床過夜。一抗孵育結束后，TBST洗滌，用HRP標記的山羊抗鼠IgG(1∶2 000)室溫孵2 h，TBST充分洗滌后，電化學發光顯影。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值，將TET1條帶與作為內參的β-actin條帶灰度值的比值作為蛋白相對表達量。

1.3 肝癌及癌旁組織中TET1 mRNA表達的檢測 采用RT-PCR法。取低溫保存的肝癌及癌旁組織100 mg置于1.5 mL的去RNA酶EP管中，加入檢測TRIzol 1 mL。按照TRIzol試劑盒的說明書提取總RNA，用紫外分光光度儀對提取的總RNA計算純度和濃度后，將提取的RNA按照逆轉錄試劑盒(日本TAKARA公司)的說明書進行逆轉錄處理，反應體系為：總RNA 400 ng、 PrimeScript RT Master Mix 2 μL及RNase Free dH2O共10 μL，37 ℃、15 min，85 ℃、5 s；PCR引物由北京賽百勝基因技術有限公司合成，以GAPDH為內參照，定量PCR擴增在羅氏定量PCR儀上進行。反應完成后計算機自動輸出cDNA模板的擴增曲線及循環閾值(Ct值)，采用2-ΔΔCt法處理數據。TET1 mRNA的表達水平檢測均采用GAPDH作為內參基因，來校正被測樣品中mRNA水平，用TET1 mRNA與各自的GAPDH的差值來表明樣本中目的基因mRNA的表達水平。

1.4 細胞培養與轉染 HepG2細胞系用DMEM培養基(含10%胎牛血清，1%青-鏈霉素)培養，于含5% CO2培養箱中37 ℃恒溫培養，1%胰酶消化傳代。轉染前接種于6孔板預先培養24 h，分別加入TET1基因過表達重組慢病毒顆粒和空載體對照慢病毒顆粒進行轉染，轉染5 h后更換完全培養液，24 h后換液，轉染后72 h開始添加2 μg/mL嘌呤毒素，通過梯度實驗篩選穩定轉染細胞，篩選1周。成功構建的TET1過表達(過表達組)及空載體HepG2細胞(對照組)凍存于液氮中，進行實驗時復蘇細胞后對TET1表達情況進行重新鑒定。

1.5 HepG2細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。取兩組細胞，以0.25%胰酶消化，分別制成1.5×104/mL的細胞懸液，接種于96孔板中，每組設6個復孔，每孔細胞懸液100 μL，鋪六孔板。培養0、24、48、72、96、120 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL置于37 ℃、5% CO2的培養箱繼續培養2 h，用酶標儀測波長450 nm處各孔的OD值，每組去掉最大值和最小值，取平均值。

1.6 HepG2細胞遷移能力檢測 采用劃痕試驗。在六孔板底面預先繪制數條參考線，用于定位劃痕位置。將兩組細胞(5×105/孔)分別接種在6孔板，每組設3個平行孔，培養24 h后，使用200 μL槍頭進行劃痕處理，PBS洗滌2次，將細胞在無血清培養基中培養。使用裝有數碼相機(德國Zeiss公司)的倒置顯微鏡，觀察并拍攝0 h及24 h劃痕照片，使用Image Pro Plus6.0軟件讀取劃痕面積，平均相對遷移距離=0 h劃痕面積/高度-24 h劃痕面積/高度，劃痕愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 肝癌組織及癌旁組織中TET1的表達比較 38例肝癌組織中TET1陽性表達9例(23.7%)，癌旁組織中TET1陽性表達27例(71.1%)，兩者TET1陽性表達率比較，χ2=17.100，P<0.01。肝癌組織和癌旁組織中TET1蛋白相對表達量分別為0.46±0.09、1.15±0.13,兩者比較，P<0.05。RT-PCR結果顯示，以TET1 mRNA在癌旁組織中表達量平均值為1，肝癌組織為0.43±0.07,兩者比較，P<0.05。

2.2 兩組增殖能力比較 培養0、24、48、72、96、120 h，過表達組OD值分別為0.212±0.004、0.228±0.005、0.301±0.007、0.393±0.006、0.432±0.007、0.582±0.012；對照組分別為0.211±0.002、0.246±0.003、0.347±0.006、0.541±0.008、0.685±0.007、0.897±0.009。在培養24、48、72、96、120 h時過表達組的OD值均低于對照組(P均<0.05)。

2.3 兩組遷移能力比較 過表達組相對遷移距離為(0.47±0.007)μm，劃痕愈合率為(14.38±1.67)%；對照組相對遷移距離為(0.94±0.08)μm，劃痕愈合率為(28.15±2.61)%。與對照組比較，過表達組的相對遷移距離短和劃痕愈合率低(P均<0.05)。

3 討論

越來越多的證據顯示，DNA甲基化狀態的異常與腫瘤的進展和癌癥患者的預后有密切關系。已有研究證實，DNA甲基化廣泛參與肝癌的發病過程[6]。胞嘧啶甲基化會導致腫瘤抑制基因的沉默從而導致癌癥形成。而DNA脫甲基化酶又會抵消這種致癌基因的作用。TET家族蛋白可以通過催化DNA的5-mC轉化成5-hmC而促進DNA的脫甲基化[7]。根據一個對887例腺癌的Meta分析得出TET1 mRNA水平在腫瘤的第一階段會下調[8]。另外，有研究證實TET1蛋白在前列腺癌和乳腺癌組織中的表達也會下調[9]，因此在本研究中，我們首先通過免疫組化法、蛋白質印跡法和實時定量PCR檢驗了肝癌組織和癌旁正常組織中TET1蛋白及mRNA表達的差異，結果顯示TET1在肝癌組織中的表達降低，說明TET1可能參與了抑制肝癌的發生。

細胞侵襲是原發腫瘤生長和轉移啟動的關鍵步驟，因此腫瘤細胞的增殖及遷移能力直接代表了癌癥的惡性程度。已有研究顯示，TET1在胃癌、卵巢癌和乳腺癌發揮抑制腫瘤生長和侵襲的作用[7]。因此，我們采用構建過表達質粒并轉染人肝癌細胞中，驗證TET1的過表達對肝癌細胞的增殖和遷移能力的影響，結果提示TET1過表達可抑制肝癌細胞的惡性生物學行為。

金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)是一種基質金屬蛋白酶(MMP)家族蛋白及其內生性的調控因子，它在細胞侵襲和上皮間質轉化過程中發揮重要的調控作用[10,11]。例如，MMP2和MMP9會通過損壞細胞基底膜和降解Ⅳ型膠原蛋白和層黏連蛋白而促進細胞侵襲。雖然機制不清，但TIMP蛋白可通過結合MMPs的活性位點或降低MMPs活酶而抑制MMPs的活性[12]。TIMP基因已被證實受DNA甲基化的調控，且已有研究證實在某些腫瘤細胞中，TIMP正是TET1發揮抑制腫瘤作用的下游調控因子[13]。因此，TIMPs可以作為我們進一步研究TET1抑制肝癌發生發展的相關信號通路的一個較好目標。

綜上所述，TET1蛋白在肝癌組織中的表達發生了下調，并且其基因的過表達會抑制肝癌細胞的增殖活性和遷移能力。說明TET1密切參與肝癌的發生發展過程中，因此，TET1可作為治療肝癌的一個靶向基因。

參考文獻：

[1] Trinchet JC. Hepatocellular carcinoma in 2014: current situation and future prospects[J]. Diagn Interv Imaging， 2014，95(7-8):705-708.

[2] Kelly AD, Issa JJ. The promise of epigenetic therapy: reprogramming the cancer epigenome[J]. Curr Opin Genet Dev， 2017，42:68-77.

[3] Ito S, Shen L, Dai Q, et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine[J]. Science， 2011，333(6047):1300-1303.

[4] Huang H, Jiang X, Li Z, et al. TET1 plays an essential oncogenic role in MLL-rearranged leukemia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2013，110(29):11994-11999.

[5] Pei YF, Tao R, Li JF, et al. TET1 inhibits gastric cancer growth and metastasis by PTEN demethylation and re-expression[J]. Oncotarget， 2016，7(21):31322-31335.

[6] Tian YP, Zhu YM, Sun XH， et al. Multiple functions of ten-eleven translocation 1 during tumorigenesis[J]. Chin Med J (Engl)， 2016，129(14):1744-1751.

[7] Hsu CH, Peng KL, Kang ML, et al. TET1 suppresses cancer invasion by activating the tissue inhibitors of metalloproteinases[J]. Cell Rep， 2012，2(3):568-579.

[8] Yang H, Liu Y, Bai F, et al. Tumor development is associated with decrease of TET gene expression and 5-methylcytosine hydroxylation[J]. Oncogene， 2013，32(5):663-669.

[9] Neri F, Dettori D, Incarnato D, et al. TET1 is a tumour suppressor that inhibits colon cancer growth by derepressing inhibitors of the WNT pathway[J]. Oncogene， 2015，34(32):4168-4176.

[10] Bourboulia D, Stetler-Stevenson WG. Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion[J]. Semin Cancer Biol， 2010，20(3):161-168.

[11] Friedl P, Alexander S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity[J]. Cell， 2011，147(5):992-1009.

[12] Zeng ZS, Cohen AM, Guillem JG. Loss of basement membrane type Ⅳ collagen is associated with increased expression of metalloproteinases 2 and 9 (MMP-2 and MMP-9) during human colorectal tumorigenesis[J]. Carcinogenesis， 1999，20(5):749-755.

[13] Chernov AV, Sounni NE, Remacle AG, et al. Epigenetic control of the invasion-promoting MT1-MMP/MMP-2/TIMP-2 axis in cancer cells[J]. J Biol Chem， 2009，284(19):12727-12734.