SphK1高表達肝癌細胞株的篩選及PF-543對其增殖能力的影響

楊芳，王欣，苑永輝，黃居梅，郭瑞娟

(1 山東省地方病防治研究所，濟南250014；2中國醫科大學腫瘤醫院·遼寧省腫瘤醫院)

原發性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年新發病例約60萬，居世界惡性腫瘤第五位，我國肝癌的死亡數占全球的55%，其發病率與病死率分別高居第四及第三位[1,2]。大量研究表明，鞘氨醇激酶與體內脂質代謝密切相關，參與細胞的增殖、分化及凋亡[3]。鞘氨醇激酶-1(SphK1)可以起到增強癌細胞活力、促進腫瘤生長和轉移的作用[4,5]。2016年10月～2017年6月，本研究篩選了SphK1的高表達株，并觀察了SphK1拮抗劑對其高表達株細胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 正常肝細胞系L02和肝癌細胞系HepG2、Huh7、Bel7402購自于中國科學院上海細胞生物研究所。DMEM培養液、RPMI1640培養液購自于Hyclone公司。胎牛血清購自于Gibco公司。TRIzol、PrimeScript RT Reagent Kit、Perfect Real Time和SphK1引物均購自TAKARA公司。細胞增殖-毒性檢測試劑盒購自日本Dojindo公司。PF-543購自Selleck公司。

1.2 細胞培養 在5%C02、37 ℃條件下，L02、HepG2細胞置于含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養液中培養；Huh7、Bel7402細胞置于含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養液中培養，2～3 d更換一次新鮮培養液，待細胞融合至80%，用0.25%胰酶消化傳代后接種于6孔板，每組設6個復孔，選對數生長期的細胞用于試驗。

1.3 組織SphK1的檢測 采用RT-PCR法。應用TRIzol提取RNA，按說明書要求操作。以紫外分光光度計檢測RNA濃度。按PrimeScript RT Reagent Kit試劑盒方法進行RT-PCR逆轉錄反應，反應體系為20 μL。使用Roche 480Ⅱ熒光定量PCR儀進行PCR擴增及結果分析。取反轉錄后的 cDNA 2 μL作為模板，按照試劑盒的說明，配制反應體系進行擴增，SphK1引物F：5′-GGGGAATTGATGGTTAGCG-3′，R：5′-AGGAAGGGTCCTGACAGTAGAT-3′，片段長度：179 bp，退火溫度為58 ℃；GAPDH引物F：5′-CCACTAGGCGCTCACTGTT-3′，R：5′-TGGAATTTGCCATGGGTGGA-3′，片段長度：228 bp，退火溫度為59 ℃。反應體系為20 μL。以GAPDH為內參RNA。目的基因的相對量通過2-ΔΔCt法來計算。以上實驗均以不含cDNA的體系為陰性對照。

1.4 細胞增殖活力的檢測 采用CCK-8法。取HepG2細胞，PBS清洗，胰蛋白酶消化，制成細胞懸液。按每孔500個接種于96孔板。培養24 h后棄培養液，加入含0.5% FBS的培養液預處理24 h，以達到細胞同步化。實驗分為5組： 10-7、10-6、2.5×10-6、10-5mol/L PF-543組及空白組，實驗組按100 μL/孔加入含藥培養液，每組設6個復孔，空白組加入等量含0.5% FBS的培養液，繼續培養72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，細胞培養箱內孵育4 h。使用酶標儀于450 nm處測OD值。

2 結果

2.1 SphK1在肝癌細胞系中的表達 HepG2細胞中SphK1的表達量最高，是正常肝細胞L02中SphK1表達量的(3.28±0.64)倍，兩者比較，P<0.01；Huh7細胞中SphK1的表達量是正常肝細胞L02中SphK1表達量的(2.07±0.26)倍，兩者比較，P<0.01，BEL7402細胞中SphK1的表達量最低，是正常肝細胞L02中SphK1表達量的0.22±0.04，兩者比較，P<0.01。

2.2 不同濃度PF-543對HepG2細胞增殖活力的影響 預處理72 h后，10-7、10-6、2.5×10-6、10-5mol/L PF-543組及空白組OD450值分別為1.03±0.06、0.82±0.08、0.67±0.05、0.43±0.05、1.03±0.07。10-6、2.5×10-6、10-5mol/L的PF-543組均低于空白組(P均<0.01)，10-7mol/L PF-543對HepG2細胞未見明顯影響。PF-543在10-6、2.5×10-6、10-5mol/L濃度范圍內對HepG2細胞增殖的抑制呈現劑量依賴性(P<0.05)。

3 討論

原發性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發生與細胞內復雜的分子機制密切相關，找到與肝癌發生、發展起關鍵作用的靶點是腫瘤治療的關鍵所在。

近年研究表明,鞘脂在腫瘤的發生、發展過程中發揮極為重要的作用，是細胞生物學功能的重要調控子。重要的鞘脂類分子如神經酰胺(Cer)和鞘氨醇(Sph)有促細胞凋亡和抑制細胞增殖的作用；鞘氨醇-1-磷酸(S1P)既可作為細胞內第二信使發揮作用，又可與細胞表面的特定受體結合而調節細胞的增殖、凋亡、遷移及黏附分子表達等[6]。S1P/Cer的平衡是決定細胞生存或凋亡的重要因素。在 S1P生物合成過程中，Cer/Sph與S1P之間形成“鞘脂變阻器”，決定細胞的存活或死亡,而SphKs是Cer/Sph與S1P平衡的重要調控分子，起關鍵限速作用[7,8]。

目前，在人類和小鼠組織中已發現有SphK1和SphK2兩種異構體存在，其中SphK1是細胞調節S1P生成的最主要分子，與多種腫瘤細胞的過度增殖有關[9]。SphK1對于維持正常細胞周期必不可少，SphK1表達增加不僅導致S1P水平升高，能對抗細胞凋亡，還能增加細胞周期由G1期向S期轉化的速率[10]。Kohno等[11]研究發現，SphK1活化能夠促進小腸腺瘤細胞增殖，抑制SphK1活性可抑制小腸癌的發生。Zhao等[12]研究發現，抑制SphK1的表達可以降低頭頸部鱗狀細胞癌的生長速度。但其在肝癌中的研究尚不明確。

為了探索SphK1在肝癌中的作用，我們選取正常肝細胞及三種肝癌細胞系作為模型進一步研究。本實驗首先從RNA水平檢測SphK1在正常肝細胞L02、肝癌細胞HepG2、Huh7、Bel7402中SphK1的表達量，證實SphK1在HepG2細胞系中的表達量高于其他細胞系，篩選出HepG2細胞系是SphK1高表達株；并進一步采用CCK-8法觀察不同濃度SphK1拮抗劑PF-543對HepG2細胞增殖能力的影響，結果顯示SphK1拮抗劑PF-543可劑量依賴性地抑制HepG2細胞增殖。

綜上所述，HepG2細胞系是SphK1高表達株，在研究SphK1與肝癌的發生機制中，HepG2細胞系是首選細胞系。SphK1拮抗劑PF-543可顯著性抑制HepG2細胞增殖，提示SphK1可能成為肝癌治療的一個潛在靶點。

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