生物三維打印技術在肝組織工程的應用與展望

游輔宇 綜述，高 毅 審校

(南方醫科大學珠江醫院肝膽二科，廣東珠江 510282)

肝臟是人體物質代謝的中心，具有眾多的功能，糖原存儲、藥物代謝、血清蛋白合成、激素代謝等均在肝臟進行。同時肝臟也是多種致病因素的攻擊靶點，急性肝衰竭、肝硬化等肝臟疾病嚴重威脅著人類的健康，肝移植是治療這些疾病的惟一有效方法。然而供體的缺乏及免疫排斥等限制了肝臟移植的臨床應用，肝組織工程是解決這一問題的希望[1]。

目前肝組織工程主要有兩種構建策略：自上而下和自下而上[2]。自上而下技術注重對肝臟宏觀結構及功能的模擬，而難以對肝臟微觀結構及細胞微環境進行模擬[3]；后者則注重對微觀結構的模擬，卻難以規模化。生物三維打印(three dimensional printing,TDP)技術因具備在微觀及宏觀兩種尺度構建組織的特點，成為連接微觀與宏觀的希望[4-6]。本文就生物TDP技術在各尺度肝組織工程的應用現狀進行總結，為生物TDP技術構建兼具微觀與宏觀結構及功能的肝組織提供參考。

1 生物TDP技術概述

生物TDP技術是以生物材料、細胞及生物學分子等為材料，通過逐層堆積精確構建具有一定空間結構和一定生物學功能組織的技術，是快速成型技術和增材制造技術的一種[7-8]。生物TDP能夠極大地提高細胞、生物材料和生物活性分子空間分布的精確性，精確控制體外模型的結構。這一特性使其在構建體外組織模型及組織工程受到越來越多的關注。

目前常用的生物TDP技術主要分為3種：噴墨式生物TDP、激光生物TDP、微擠出式生物TDP[7,9-10]。噴墨式生物TDP機及激光生物TDP機均能夠在微觀層次實現對細胞及其微環境的操控；而微擠出式生物TDP機具備在宏觀層面對大量肝細胞進行排布的能力。

2 生物TDP技術在微觀尺度構建肝組織

噴墨生物TDP機通過熱能或聲壓控制一定體積的含細胞液滴分布到預設位置實現TDP，是最常用的打印機類型，具有價格低、高分辨率、打印速度快、能夠兼容多種生物材料、打印精度可調等眾多優點[7]。2013年MATSUSAKI等[11]利用噴墨生物TDP機在單細胞層次實現對肝細胞和內皮細胞進行打印；成功構建了具有多層細胞結構的肝組織芯片。檢測肝細胞功能顯示，相較于簡單的三維培養、三明治培養，具備此種精確結構的肝組織芯片具有更好的清蛋白分泌、細胞色素酶 P450(CYP450)同工酶誘導與代謝功能。Organovo公司利用自主研發的TDP機構建出類似肝小葉結構，具有良好的CYP酶活力的微肝組織[12-13]。

激光生物TDP機基于激光介導轉移的原理，利用激光使黏附在平板上特定位置的細胞脫落，從而構建三維結構。其具有打印精度高(可精確至單個細胞)，細胞活力高(達95%)、對細胞損害小、細胞打印密度高等優點。2016年MA等[14]利用激光生物TDP機成功打印具有肝小葉結構的肝組織模型，此組織中細胞具有良好的形態學特征，肝組織的分泌及代謝功能均得到了良好的表達。可見，生物TDP技術能夠在微觀層次，以細胞為“磚塊”進行三維搭建，精確化、標準化的定義細胞位置及其微環境，從而構建具有良好功能的微肝組織。

3 生物TDP技術在宏觀尺度構建肝組織

微擠出式生物TDP機通過氣壓、活塞、螺旋等方式將液體或凝膠狀生物墨水連續擠出從而構建三維模型[7]。適用于微擠出的生物TDP機材料包括水凝膠、具有生物相容性的聚合物材料，細胞球等。此種生物TDP機可兼容較高的細胞密度，能夠實現對大量細胞的宏觀排布，在組織工程規模化方面具有很大的優勢[7]。WANG等[15]利用微擠出式生物TDP技術打印細胞凝膠混合物構建具有多層空間結構的肝組織，此組織細胞能夠保持至少2個月的活力及功能，表明其具備規模化構建人工肝組織的可能。此后多個研究利用擠出式生物TDP機進行肝組織打印，且構建的肝組織具有良好的功能[3,6,16-18]。2017年JEON等[19]利用微擠出式生物TDP技術構建的肝組織塊細胞數量可達到1×107/mL水平，接近體內組織細胞數量級水平。此外有研究將擠出式生物TDP機構建的肝組織塊移植入肝損傷模型小鼠體內，肝組織表現出更好的活力及功能[20]。綜上所述，擠出式生物TDP機具有規模化、標準化的構建出可用于移植的人工肝組織的可能。

4 生物TDP技術連接宏觀與微觀的橋梁

模塊化構建肝組織工程技術便是基于生物TDP技術特性所提出的一種新型組織工程策略[21]。這種策略的基本方法為大規模構建組織器官的基本功能/結構單元，而后對這些基本單元為模塊進行仿生組裝，從而得到兼具微觀與宏觀結構功能的組織[21]。生物TDP技術因其在微觀和宏觀層次均能夠規模化、標準化精確構建具有復雜三維結構的組織而成為此種策略的重要工具，成為連接微觀與宏觀之間的橋梁。

2017年YANAGI等[22]提出了一種利用生物TDP技術將肝芽樣細胞球組裝為宏觀肝組織的方法；作者首先大規模構建由肝細胞、人臍靜脈內皮細胞、骨髓間充質干細胞混合組成的肝芽樣細胞球(直徑500～600 μm)；以細胞球為基本模塊進行打印組裝從而構建規模化的肝組織。構建的肝組織具備體外自我修重能力，并有向肝組織結構方向演化的可能。將構建的肝組織移植入小鼠體內后檢測到組織具備清蛋白分泌功能及CYP酶活性；并具有再發生成膽小管的可能。目前利用TDP技術連接微觀與宏觀構建肝組織的文獻報道較少，然而仍可看出生物TDP技術相較于傳統組織工程技術，其具備成為連接微觀與宏觀橋梁的可能性，是肝組織工程重要的技術方法。

5 生物TDP技術在構建血管網絡中的應用

血管化是限制宏觀組織構建的重要因素[23]。合理的血管分布是保證人工組織能夠獲取足夠營養物質、排出廢物、存活并表達相應功能的重要保證[24]。近年來生物TDP技術已經被用于構建內皮化、可灌注的三維血管網絡。MILLER等[25]利用TDP技術將直徑為200 μm的糖玻璃網絡打印在包埋有小鼠原代肝細胞的凝膠組織中，而后將糖玻璃溶解并內襯于內皮細胞從而成功構建血管網絡。2017年MASSA等[26]結合水凝膠支架、生物TDP技術及微流控技術構建了一種含血管的肝組織芯片，利用肝組織芯片進行藥物篩選表明含有人工血管的組織具有更接近體內的性質。目前利用生物TDP技術構建肝組織血管網絡的報道較少，但可看出生物TDP技術具備構建具有復雜三維結構的血管網絡的能力與前景。

6 生物TDP肝組織動物體內移植

目前生物TDP技術構建的宏觀肝組織塊只進行了少量的動物實驗。由于對微觀結構、宏觀組織、血管網絡三者現階段無法進行良好的整合，在移植進行過程中無法實現有效的血管吻合。因此，目前動物實驗所采用的主要移植方式是將打印的肝組織塊種植于小鼠肝臟表面或大網膜中。2017年KANG等[20]將生物TDP的肝組織塊植入肝損傷小鼠網膜之中，結果表明，與體外比較，植入小鼠體內的肝組織表現出更好的功能。盡管生物TDP肝組織技術仍不成熟，然而動物實驗表明了其應用于移植的可能。

7 展 望

生物TDP技術仍然處于其發展的初期[7]。盡管其在各尺度的肝組織工程均表現出獨特的優勢，然而利用生物TDP技術消除微觀與宏觀的鴻溝，構建具有功能并可用于移植的肝組織仍面臨巨大的挑戰。當前限制生物TDP肝組織面臨的挑戰主要集中在3個方面：打印技術、生物材料與種子細胞、打印策略。

微觀肝組織的構建需要在打印精度、打印速度、細胞活力三者間尋找合適的平衡；在快速構建微肝組織的同時需具備足夠精度及保證較高細胞活力，才可為宏觀構建肝組織提供足夠可用的微模塊。而宏觀組織同樣具有復雜的三維結構。目前的生物TDP技術均難以同時在多方面滿足構建需求；由此研發新的、具備平衡上述各種要求能力的打印機是促進生物TDP技術的重要方面。生物TDP技術是對種子細胞及生物材料的有序組裝過程。種子細胞是決定TDP肝組織功能的基石，目前用于打印的細胞有腫瘤細胞系、原代細胞、干細胞等，這些細胞有著各自的特點與缺陷；近年來干細胞因具有分化為不同特定功能細胞的特性，是近年來最受關注的細胞來源之一。特別是誘導多功能干細胞能夠從患者組織中獲取細胞，經過重新編程獲得，解決了來源的限制；且由于與患者細胞同源，不存在免疫排斥的問題。TDP技術生物材料的物理化學性質在很大程度上限制了生物TDP方法選擇，間接限制了打印的速度、精度等。同時良好的生物材料具備保護種子細胞，促進種子細胞功能表達與維持等重要作用。

目前生物TDP技術規模化構建策略單一，可選擇的生物TDP機及兼容的打印微肝組織模塊少。研制可兼容微肝組織模塊及血管網絡的新型打印機，制訂合理的、標準化的構建策略是當前的重要方向。盡管生物TDP技術仍然存在著許多不足，但隨著技術的發展，生物TDP技術在空間與時間精度上的提升，生物材料及種子細胞的優化，生物TDP技術將成為有效、可靠、快速的肝組織構建方法。