“附子-白術(shù)”藥對對破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞增殖、分化及活力的影響?

程旭鋒，張新峰，劉 琦，喬翠霞，趙慧朵，馬書平

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450008； 2. 河南省腫瘤醫(yī)院，鄭州 450008； 3.河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450008； 4.河南省中醫(yī)藥研究院，鄭州 450008)

隨著抗腫瘤技術(shù)的提高，癌癥患者的生存時(shí)間不斷延長，其發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)也在不斷增加，如晚期乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高達(dá)65 %～75 %[1-2]。臨床治療骨轉(zhuǎn)移癌的主要藥物雙磷酸鹽、地諾單抗等，主要是通過抑制破骨活性而減輕骨吸收，并不能修復(fù)已存在的骨損傷。前期研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，《金匱要略》白術(shù)附子湯及其核心藥物“附子-白術(shù)”藥對可抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移、修復(fù)骨損傷，然而其作用機(jī)理尚不清楚。本文旨在研究“附子-白術(shù)”藥對對破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞增殖、分化及功能的影響，為“附子-白術(shù)”藥對防治惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與材料

10只出生48 h以內(nèi)的SPF級(jí)Sprague-Dawley (SD)大鼠，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)SCXK(豫)2010-0002)。

DMEM培養(yǎng)基、α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、0.25%胰蛋白酶溶液均為美國Invitrogn公司產(chǎn)品；β-甘油磷酸鈉、 磷酸化抗壞血酸(ASAP)、 地塞米松、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、17β-雌二醇 (17β-estradiol，E2)、1α, 25-(OH)2VitD3、Triton X-100、RANKL、M-CSF、抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 染色試劑盒均為美國Sigma公司產(chǎn)品；抗酒石酸酸性磷酸酶測定試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品(批號(hào)20140805)；堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP) 測定試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品(批號(hào)20140805)；附片配方顆粒(批號(hào)140321)、白術(shù)配方顆粒(批號(hào)140615)均為江陰天江藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 “附子-白術(shù)”藥對藥液的制備

附片配方顆粒20包(每包相當(dāng)于制附子3 g)、白術(shù)配方顆粒4包(每包相當(dāng)于白術(shù)10 g)溶于1000 ml的DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，制備成100 mg·mL-1的“附子-白術(shù)”藥對溶液；采用DMEM培養(yǎng)液稀釋，制備實(shí)驗(yàn)所需濃度的“附子-白術(shù)”藥對溶液(1 mg·mL-1、10 mg·mL-1)。

1.3 附子白術(shù)藥對對破骨細(xì)胞的影響

1.3.1 乳鼠破骨細(xì)胞制備與分組 無菌條件下迅速取出出生48 h以內(nèi)SD大鼠的長骨，PBS沖洗骨髓腔，采用細(xì)胞濾網(wǎng)過濾細(xì)胞，采用Histopaque 1077 (Sigma)細(xì)胞分離液分離單核細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板中；單核細(xì)胞采用含10%的胎牛血清、50 ng/ml的RANKL和 30 ng/ml的M-CSF α-MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)液1次，采用0.1%膠原酶和0.2%中性蛋白酶去除基質(zhì)細(xì)胞；培養(yǎng)7 d左右，待細(xì)胞鋪滿70%～80%孔底時(shí)胰蛋白酶消化傳代，接種于24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞鋪滿孔底時(shí)進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組為對照組、藥對低劑量組(1 mg·mL-1)和藥對高劑量組(10 mg·mL-1)。

1.3.2 TRAP 染色陽性計(jì)數(shù)[6-7]將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的破骨細(xì)胞按照1.3.1項(xiàng)分組，每組6個(gè)復(fù)孔(n=6)，培養(yǎng)24 h吸棄上清液，加入含/或不含各劑量藥對的培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)72 h；PBS 沖洗3次，10%的甲醛固定3 min，蒸餾水沖洗，0.5% Triton X-100 37 ℃處理10 min。按抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒說明書進(jìn)行 TRAP染色，二甲苯透明，中性塑膠封片，顯微鏡下觀察，計(jì)算整張玻片中TRAP陽性細(xì)胞數(shù)(N)。細(xì)胞相對抑制率=(N對照組-N給藥組)/N對照組×100%。

1.3.3 破骨細(xì)胞TRAP酶活力的測定[6-7]將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的破骨細(xì)胞按照1.3.1項(xiàng)分組，每組4個(gè)復(fù)孔(n=4)，培養(yǎng)24 h吸棄上清液，加入含/或不含各劑量藥對的培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)72 h；PBS 沖洗3次，0.5% Triton X-100 裂解，然后按照抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP) 測試盒說明書進(jìn)行，于酶標(biāo)儀上檢測530 nm處吸光度并記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)說明書計(jì)算公式換算成金氏單位(以U/L表示)。

1.4 附子白術(shù)藥對對成骨細(xì)胞的影響

1.4.1 乳鼠顱骨成骨細(xì)胞的培養(yǎng)[6-7]與分組 無菌條件下迅速取出出生48 h以內(nèi)SD乳鼠的頭蓋骨剪碎(約1 mm×1mm)，37 ℃條件下0.25%胰酶消化20 min，棄上清液，0.1% Ⅱ型膠原酶消化2次，每次30 min，收集并合并2次上清液，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液以終止消化，4 ℃溫度下1000 r/min離心10 min去上清液，加入含15% FBS 的DMEM培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液，接種于24 cm2培養(yǎng)皿，24 h后更換培養(yǎng)液，除去未貼壁的細(xì)胞，以后每3 d換液1次；培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿70%～80%皿底時(shí)胰蛋白酶消化傳代，制備原代細(xì)胞懸液。原代細(xì)胞懸液以5×107個(gè)/L濃度接種于24 cm2培養(yǎng)皿，每皿12 ml，每2～3 d換液1次，待培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿70%～80%皿底時(shí)，胰蛋白酶消化傳代(記為P1代)；將P1代細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞鋪滿80% 孔底時(shí)，加入含0.1 mol/L的β-甘油磷酸鈉和10-7mol/L的地塞米松及50 mg/L的ASAP培養(yǎng)液進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞分組進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對照組、藥對低劑量組(1 mg·mL-1)和藥對高劑量組(10 mg·mL-1)。

1.4.2 MTT法檢測成骨細(xì)胞的增殖[6-8]將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的成骨細(xì)胞按照1.4.1項(xiàng)分組，每組6個(gè)復(fù)孔(n=6)，培養(yǎng)24 h吸棄上清液，加入含/或不含各劑量藥對的培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)48 h，并以全培養(yǎng)液(不含破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞)為空白對照組(培養(yǎng)液組)；每孔加入10 g/L的MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸棄各孔上清液，分別加入150 μL DMSO振蕩10 min，酶標(biāo)儀于570 nm波長下檢測各孔吸光度(A)。相對增殖率(%)=(A給藥組-A對照組)/(A對照組-A培養(yǎng)液組)×100%。

1.4.3 成骨細(xì)胞ALP活性的測定[6-8]將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的成骨細(xì)胞按照1.4.1項(xiàng)分組，每組4個(gè)復(fù)孔(n=4)，培養(yǎng)24 h吸棄上清液，加入含L-抗壞血酸(50 mg/L)、β-甘油磷酸鈉(10 mol/L)、地塞米松(10 μmol/L)和各劑量藥對的培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)72 h；按照堿性磷酸酶試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀于507 nm波長下檢測各孔吸光度，根據(jù)說明書計(jì)算公式換算成金氏單位，再用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量，ALP活性以U/μg表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 “附子-白術(shù)”對破骨細(xì)胞增殖和TRAP 活力的影響

圖1顯示，破骨細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，邊緣呈不規(guī)則形態(tài)，經(jīng)TRAP 染色后會(huì)在酶活性部位形成不溶性棕紅色染料。在顯微鏡下，可以清晰地看到胞漿呈棕紅色、細(xì)胞核數(shù)大于 3的陽性細(xì)胞，即為破骨細(xì)胞。表1所示，“附子-白術(shù)”藥對低濃度(1 mg/L)、高濃度組(10 mg/L)破骨細(xì)胞數(shù)量明顯低于對照組(P<0.05，P<0.01)，細(xì)胞抑制率分別為14.28%、32.74%；與對照組比較，“附子-白術(shù)”藥對組(1 mg/L、10 mg/L)TRAP活力值均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

圖1 各組破骨細(xì)胞TRAP染色

表1 各組破骨細(xì)胞增殖和TRAP酶活力結(jié)果

注：與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 “附子-白術(shù)”對成骨細(xì)胞增殖和ALP活力的影響

表2顯示，“附子-白術(shù)”藥對低濃度(1 mg/L)、高濃度組(10 mg/L)在570 nm 處的吸光度值明顯高于對照組(P<0.05，P<0.01)，細(xì)胞相對增殖率分別為9.09%、24.24%；與對照組比較，“附子-白術(shù)”藥對組(1 mg/L、10 mg/L)ALP活力值均顯著升高(P<0.01)。

表2 各組成骨細(xì)胞增殖結(jié)果

注：與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

骨轉(zhuǎn)移癌屬于中醫(yī)學(xué)“骨痹”“濕痹”等范疇，其發(fā)生發(fā)展與中醫(yī)腎脾關(guān)系密切[3-5]?！端貑枴の迮K生成》曰： “腎之合骨也，其榮在發(fā)，其主脾也?！薄毒霸廊珪愤M(jìn)一步指出： “脾腎不足及虛弱失調(diào)之人，多有積聚之病。”在生理上，脾與腎相互資助、相互促進(jìn)，病理上脾與腎更是相互影響、互為因果。腎陽不足，不能溫煦脾陽致脾陽不振；脾陽虛弱，可損及腎陽引起腎陽亦虛，二者最終均可導(dǎo)致脾腎陽虛，即脾與腎在病理上存在惡性循環(huán)關(guān)系，單獨(dú)溫腎或健脾均不能取得良好的臨床療效。因此，本課題組在既往文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)[3-5,9-14]上提出，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療當(dāng)脾腎同調(diào)，使后天之精源源不斷地化生充養(yǎng)先天，先天之精旺盛又能不斷地滋養(yǎng)后天；腎陽得溫，脾胃得健，骨轉(zhuǎn)移癌方得以抑制?！案阶?白術(shù)”藥對為《金匱要略》附子白術(shù)湯的核心藥物，具有溫腎陽健脾、通絡(luò)止痛等功效。前期研究[3-5]證實(shí)，“附子-白術(shù)”藥對可抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移，減輕骨損傷。本研究考察“附子-白術(shù)”藥對對破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的影響，探討其防治骨轉(zhuǎn)移癌的機(jī)理。

正常的骨代謝需要破骨細(xì)胞介導(dǎo)的“骨吸收”和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的“骨形成”維持動(dòng)態(tài)平衡[15-16]；惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移損傷以溶骨性損傷為主，惡性腫瘤及其分泌的細(xì)胞因子可導(dǎo)致破骨細(xì)胞的“骨吸收”增強(qiáng)，并抑制成骨細(xì)胞的“骨形成”作用減弱，從而引起溶骨性損傷。因此，抑制破骨細(xì)胞的增殖、促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化，才將有望修復(fù)溶骨性損傷[6-8]。本研究中TRAP 染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，“附子-白術(shù)”藥對低、高劑量(1 mg/L和10 mg/L)能顯著性抑制破骨細(xì)胞的增殖。破骨細(xì)胞來源于骨髓產(chǎn)生的破骨細(xì)胞前體，本實(shí)驗(yàn)采用培養(yǎng)基中所含的1α,25-(OH)2Vit D3具有誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體分化成熟的功能，因此TRAP染色的細(xì)胞數(shù)目既包括成熟的破骨細(xì)胞，也包括經(jīng)誘導(dǎo)而來的破骨細(xì)胞，表明“附子-白術(shù)”藥對可能具有抑制骨髓細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化及破骨細(xì)胞增殖的作用。TRAP為破骨細(xì)胞分泌的特異性酶，其活力可代表破骨細(xì)胞的骨吸收能力和活性[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，“附子-白術(shù)”藥對低、高劑量(1 mg/L和10 mg/L)組能夠顯著性抑制TRAP活力，表明“附子-白術(shù)”藥對可能具有抑制骨髓細(xì)胞的骨吸收能力和活性的作用。

成骨細(xì)胞由間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育而來，成骨細(xì)胞可分泌細(xì)胞外基質(zhì)，在骨微環(huán)境下礦化為骨基質(zhì)，骨基質(zhì)中的成骨細(xì)胞分化成熟后可形成骨細(xì)胞[18]，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，有望成為治療各種溶骨性骨損傷的有效方法。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低、高劑量的“附子-白術(shù)”藥對(1 mg/L和10 mg/L)可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。ALP是成骨細(xì)胞所分泌的蛋白酶，是成骨細(xì)胞分化的特異性標(biāo)志物[19]。本實(shí)驗(yàn)低、高劑量的“附子-白術(shù)”藥對(1 mg/L和10 mg/L)可增強(qiáng)ALP的活性，說明其可促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)“附子-白術(shù)”藥對具有抑制骨髓細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，并抑制破骨細(xì)胞的增殖和活性及骨吸收功能的作用，同時(shí)也能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，將為臨床治療惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移提供理論和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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