細胞外囊泡
——肝臟疾病診斷中的重要標志物和潛在治療靶點*

龔俊華，游 逾，龔建平

(重慶醫科大學附屬第二醫院肝膽外科 400010)

1 細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)概述

隨著對EVs生物學特性的深入理解，描述EVs的術語已經發生了很大變化，過去常互換使用的“微泡”、“外泌體”和“微粒”等術語已被重新定義[1]。現在認為外泌體、微泡和微粒都是屬于EVs的亞群，它們共同組成了EVs群體[1]。外泌體是起源于多泡體、直徑為50～150 nm的勻質小囊泡[2]；微泡則是由細胞膜直接產生，直徑為100～1 000 nm[3]；凋亡小體形態類似細胞碎片，直徑為500～2 000 nm[3]。在這些亞群的相互鑒別方面，一些蛋白質，如脂筏結構蛋白1、熱休克蛋白70或主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類和Ⅱ類蛋白質等，曾被視為區分不同EVs亞群的標記物，然而新近研究表明這些標記物并不具有特異性[4]。隨著組織化學技術的迅速發展，特定的分子模式未來將有助于對不同類型囊泡的認識和鑒別，但由于提取技術、鑒定方法及命名學的混亂等原因，現在區分這些亞群仍然很困難。因此，在本文中使用統一的術語“EVs”來特指微泡和外泌體[1]。

EVs由囊內容物(蛋白質、脂質和核酸)和其外圍包裹的磷脂雙分子層組成[1]。在肝臟中，肝細胞分泌的EVs可通過細胞外液而進入血液循環。EVs攜帶的內容物信息代表了分泌之初其親代細胞的細胞狀態，且這些內容物會隨著親代細胞分泌EVs時的狀態和所處環境的改變而發生動態的變化[5]。雖然EVs最初被認為不具備生物學研究價值而并未引起重視，但近年研究表明,EVs是細胞間信息傳遞的重要紐帶，肝臟和其他組織分泌的EVs為臨床診斷各種肝臟疾病提供了重要的生物標志物，并可能成為肝臟疾病潛在的治療靶點。

2 肝源EVs及其作用靶點

2.1源于肝臟的EVs 肝細胞既可以分泌EVs，同時也是其自身分泌的或者其他器官產生的EVs的作用靶點[6]。在體外實驗中發現，肝臟中的大多數細胞，包括肝細胞、膽管細胞、肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)、內皮細胞(sinusoidal endothelial cells，SECs)、庫普弗細胞及其他免疫細胞群如巨噬細胞等，都可以分泌EVs[1]。各種肝細胞(包括小鼠和人類原代肝細胞及肝癌細胞系)都能分泌外泌體和微泡。在不同的肝臟疾病中，這些囊泡的數量和內容物均可不同，且都能對細胞間的信息傳遞進行調控[7]。蛋白質組學分析表明，大鼠肝細胞源EVs中大約251種蛋白產自原代的肝細胞[8]。在對包括EVs中所描述的四旋蛋白及其他類型的細胞表面標記(包括CD63、CD81和CD82)及脫唾液酸糖蛋白受體1跨細胞膜蛋白進行研究后發現，由肝細胞分泌的EVs可引起上述蛋白中肝細胞特異性受體水平增多。肝細胞源EVs攜帶的內容物涉及多種功能的蛋白質，如細胞色素蛋白、凝血相關蛋白和載脂蛋白類，此外肝細胞分泌的EVs還參與了肝臟解毒過程[1]。在肝硬化中，有研究發現，肝硬化患者與健康個體相比血漿中肝細胞衍生的EVs含有較高的細胞角蛋白18，而且相關白細胞內皮衍生物和肝細胞性EVs的數量與肝硬化程度密切相關[1]。除了肝細胞，SECs也可分泌功能性EVs,被內吞攝取后的SECs源性EVs可觸發依賴1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)的HSCs遷移，表明EVs在SECs和HSCs之間起著調節溝通作用[9]。肝臟中豐富的免疫細胞群為EVs提供了另一個重要的來源：體外研究表明，免疫細胞來源的EVs可以介導肝臟中不同類型的免疫細胞和實質細胞之間進行信息傳遞[10]。

雖然有關外泌體介導肝臟細胞間信息傳遞已有大量報道，但其所涉及的肝臟生物學進程及其具體機制還未闡明，有待進一步探索。比如在缺血再灌注損傷或部分肝切除小鼠模型中，肝細胞來源的EVs可調節肝臟修復，并通過轉移神經鞘氨醇酶和鞘氨基醇激酶2促進肝臟再生，同時增加靶細胞中S1P的產生[11]。另一項研究發現，肝細胞在乙醇暴露后通過外泌體轉移miRNA-27a可造成M2表型巨噬細胞活化，實現巨噬細胞與巨噬細胞間的信息傳遞[5]。以上研究表明，EVs可由肝臟中一種細胞釋放而由另一種細胞攝取，由此完成生物信息分子(如miRNAs)介導的細胞間信息傳遞，最終引起受體細胞的功能變化[1]。此外由于EVs的內容物會隨著肝臟細胞所處環境和狀態的變化而改變，所以EVs可作為一種生物標記物用于肝臟疾病的檢測[1,8]。

2.2肝臟是EVs的作用靶點 目前主流觀點認為，肝臟是機體EVs分布和作用的主要靶點之一，而這與肝臟攝取了大量非肝臟源EVs有一定關系[12]。雖然有研究表明，特定的EVs配體，如跨膜四蛋白或MCHⅠ和MCHⅡ，可以通過不同的信號通路與靶細胞直接進行信息交流而不需要攝取EVs，但大多數EVs功能的發揮還是通過EVs攝取后的信息釋放[13]。細胞攝取EVs的方式主要是通過內吞途徑，包括網格蛋白依賴和非網格蛋白依賴的內吞[14]。而肝臟正是EVs細胞內吞的高活性區域：IMAI等[15]報道源自小鼠黑色素瘤細胞系B16BL6并標記了PKH26的外泌體能被肝臟和脾臟中的巨噬細胞吞噬攝取，但卻不能被肺的巨噬細胞攝取。此外，BALA等[16]對miRNA-155基因敲除的小鼠靜脈注射含miRNA-155外泌體豐富的血漿并進行相關檢測后發現：肝臟中miRNA-155的表達明顯增加，而腎臟卻增加不明顯，提示肝臟細胞中確實發生了外源性外泌體內信息分子的攝取；在肝臟中miRNA-155表達變化最明顯的是肝細胞和肝臟單核細胞，表明機體外泌體的快速攝取和清除主要是由肝臟完成的；在該實驗中，血清外泌體濃度峰值在注射5 min后，而30 min后循環中已幾乎測不到外泌體，表明了外泌體在體內的快速生物學分布和代謝過程。此外還有研究表明，EVs攜帶的miRNA-146a和miRNA-155可調節小鼠對內毒素引發的炎癥反應[17]。總之，這些研究表明以肝臟細胞為靶點的外泌體廣泛參與了肝臟多項生物學進程。

3 EVs在各種肝臟疾病中的作用

關于EVs在各種肝臟疾病如病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、藥物性肝損傷(DILI)、肝纖維化及肝癌等中的作用已有多篇報道，本文不再贅述。

4 EVs可作為肝臟疾病診斷的生物標志物

4.1以EVs作為生物標志物的優勢 尋找生物標記物是肝臟疾病的一種早期診斷方法，可用于監測和評價各種肝臟疾病的診療情況。雖然肝臟活檢仍然是診斷肝臟疾病的金標準，但生物標記物在肝臟疾病的無創檢測和判斷分期方面仍有很廣泛的應用，如利用“體液活檢”尋找生物標記物，可以減少或者避免對肝臟的有創檢查。目前，肝損傷程度評估多基于血液肝臟酶譜檢查，如丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)和γ-谷氨酰氨基轉移酶(GGT)。然而，這些傳統酶類標記物對肝臟疾病診斷特異性欠佳，也不能反應肝病的進展階段或肝細胞損傷程度。因此，尋找新的診斷肝臟疾病的生物標志物很有必要。

EVs在肝臟疾病中作為生物標志物有以下優點：(1)由于外層有膜覆蓋，EVs可保護其內的蛋白質和核酸不被降解。(2)EVs富含特異性選擇標記物，這些標記物在體液的總蛋白組中只占了很少的一部分(<0.01%)[18]。這種診斷分子富集的優勢使EVs有能力檢測到現有檢測手段難以檢測到的低豐度核酸或蛋白質生物標記。(3)EVs作為生物標志物，與總血漿或血清相比，將降低化驗分析的復雜性。(4)EVs的數量反映了組織中細胞新陳代謝的快慢，對其攜帶物進行分析可以為疾病進展、恢復和藥物反應提供直接的信息。因此，探索新的EVs中核酸和蛋白生物標記物可為評估疾病進展、預后和治療反應開辟新的途徑。EVs中特定蛋白質或核酸水平也可作為生物標志物用于檢測不同的肝臟疾病，然而在現有的獨立研究中還無一種生物標志物在臨床上得到驗證，亦少見關于這些生物標志物在肝病中敏感性和特異性的研究報道，相關應用仍有待進一步研究。

4.2外泌體中蛋白質作為肝臟疾病生物標志物的潛在應用 有關將EVs中蛋白質信息應用于肝臟疾病生物標志方面，已有數種蛋白獲得了認可，包括全長可溶性受體型酪氨酸蛋白磷酸酶γ(sPTGRG)、結締組織生長因子(GTGF)和S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)等。在人和大鼠的血漿中，與EVs有關的sPTGRG亞型已經被認定為肝臟損傷的生物標記物[19]。分別對低ALT水平(ALT<40 U/mL)或高ALT水平(ALT>450 U/mL)人血漿樣品觀察后發現，血漿中sPTGRG水平與肝臟的損傷程度呈正相關[19]。EVs還被證明是CFGT的傳送器：其可在HSCs間傳遞CTGF并放大纖維增生信號。有研究發現，含有CTGF的EVs可作為一種非侵入性的蛋白質生物標記物來評估肝纖維化的嚴重程度[20]。在一項蛋白質組學研究中，從人工培養的肝細胞中分泌以及肝損傷的小鼠血清中提取的EVs，一些肝臟特異性蛋白的水平有所增加，如氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、SMAS和兒茶酚-O-甲基轉移酶(COMT)；通過對部分肝切除的小鼠進行觀察后發現，SAMS的上調是肝臟組織再生的必要條件[21]。利用親和力分離的方法，可以從肝細胞癌患者血液循環的EVs中分離出特異性單克隆抗體。這些肝臟特異性循環EVs的水平在患者體內有所增加，并與肝癌的大小密切相關。在另一項對急性肝損傷動物模型尿液樣本的研究中，發現差異表達蛋白質CD26、CD81、SLC3A1和CD10，可作為肝病的生物標志物。在對D-氨基半乳糖急性肝損傷患者進行治療時，通過對小鼠尿液中EVs檢測發現，一些通常可在尿中明確地檢測到的蛋白質數量明顯減少，表明尿中EVs的蛋白質攜帶物可以反映肝臟的損傷程度[22]。

4.3外泌體中核酸作為肝臟疾病生物標志物的潛在應用 與EVs相關的核酸，特別是miRNAs作為多種肝臟疾病的生物標志物，已引起了廣泛關注。研究表明miRNAs可以為肝癌的潛在生物標志物，與肝癌經肝切除術后未復發的患者相比，肝癌術后復發的患者血漿中外泌體內miRNA-718表達明顯減少。對一個獨立患者隊列進行的研究表明，miRNA-718水平的下降與肝細胞肝癌(HCC)腫瘤的高侵襲性相關[23]。肝癌患者含有miRNA-21的血清EVs水平與EVs耗竭血清相比有所增加，和健康人及慢性乙型肝炎患者相比，HCC患者血清外泌體中的miRNA-21的水平較高。雖然血清miRNA-21表達水平在肝硬化后肝癌中的診斷價值早已獲得認可，但EVs中miRNA-21相較而言具有更高的診斷敏感性[24]。

不同程度的乙醇性肝損害，或者對乙酰氨基酚或Toll樣受體(TLR)9配體[胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸(CpG)和脂多糖(LPS)]肝損害模型中，血清和血漿中miRNA-122的水平隨著血清ALT水平的升高而增加。患有與炎癥相關的肝病(如乙醇性肝損害或CpG和LPS處理后的肝損害)的小鼠體內，miRNA-155和miRNA-146a等炎癥相關miRNAs在血清和血漿中均有升高[25]。在模擬乙醇介導的肝損害如乙醇性肝損害或CpG和LPS處理后的肝損害模型中，血清及血漿miRNA-122和miRNA-155則主要與小鼠體內的EVs豐度有關；與健康的個體相比，急性酒精性肝炎患者循環EVs的數量也有所增加。通過與健康個體對比并針對每個人分別建立的基礎基線水平后發現，酒精性肝炎患者或酗酒后，EVs的數量和囊泡中miRNA-122的水平均大幅提高。miRNA-192和miRNA-30a在長期飼飲乙醇的小鼠或慢性酒精性肝炎患者的血清中提取的EVs中表達均升高。在這些miRNAs中，miRNA-192對酒精性肝炎的診斷準確性最高[26]。綜上所述，EVs中核酸水平可以作為各種肝臟疾病診斷及判斷其嚴重損害程度的生物學標志物。

5 EVs作為肝臟疾病的治療方法

使用EVs特別是外泌體，可作為藥物干擾RNA(RNAi)的潛在有效載體。生物相容性和對核糖核酸酶、朊酶類的抗性及轉移的穩定性使EVs成為藥品的理想載體，否則蛋白質、miRNA、沉默RNA(siRNA)等其他分子會迅速降解。EVs為組織針對性的siRNA和miRNAs調控基因在靶細胞中表達提供了一條新途徑。研究證實肝臟是靜脈注射后EVs主要的攝取部位[16]，表明EVs在信息傳遞中的潛在用途及以RNA為基礎的靶向RNA干預療法在肝臟疾病中的應用潛力。有研究發現，EVs在體內外均可有效地向巨噬細胞和肝細胞提供miRNA-155過表達或抑制信號[16]。miRNA-155早已被證明是一種調解人酒精性肝病和肝臟炎癥的重要物質，但如何靶向運送miRNA-155仍是相關應用的主要障礙。一項新近研究選取來自B細胞源的EVs(其miRNA-155的天然水平很低，被視為外源miRNA-155合成模擬信號并抑制RAW巨噬細胞的理想載體)并傳遞miRNA-155至靶細胞，發現對miRNA-155的干預誘導了RAW巨噬細胞的抑制，并使腫瘤壞死因子(TNF)蛋白活性產物下降超過大于50%[27]。提取miRNA-155敲除小鼠體內的肝細胞后發現，EVs能成功地向肝臟傳遞一個外源性的miRNA-155模擬信號[16,27]。

有研究表明，EVs參與了修復組織和器官損傷，這也可以解釋其在干細胞治療中的旁分泌效應[28]。EVs的內容物可以引起細胞的聚集、分化和增殖，在動物模型中，間充質干細胞(MSC)衍生的EVs可在DILI誘導白細胞介素6(IL-6)-轉錄激活因子3(STAT3)通路及細胞周期進程中促進肝細胞再生[28]。在四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化模型中，源于人臍帶MSC的EVs可減輕肝纖維化，其機制可能與減少表面纖維形成，減少Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的產生，降低血清轉化生長因子β(TGF-β)與血清AST的水平有關[29]。利用干細胞衍生的EVs替代干細胞植入物可能為肝臟再生療法提供了一種新手段，其優點包括：(1)使用來自于肝細胞的EVs，而不是細胞本身，避免了對異常干細胞的誘導分化，避免高免疫反應的風險。(2)與免疫抑制相關的某些類型的EVs可以促進肝組織再生。(3)EVs和外泌體可從血液中分離出來并儲存，保持其長久以來的生物學特性，促進其在后期肝再生中發揮作用。盡管EVs為避免在再生醫學中使用活細胞而引發的并發癥提供了希望，但是MSC衍生的EVs在已知的前致癌物及其抗癌特性等方面還有待進一步研究。

6 問題與展望

EVs是一種新近發現的潛在生物標記物，但在肝臟疾病診斷、預后判斷和預測價值中的作用尚缺乏足夠的證據。有必要進行獨立的綜合研究及具有良好特征患者群體的整體評價，這樣才能充分證明EVs生物標志物在臨床應用中的敏感性和特異性。有關肝臟疾病中EVs生物標志物的相關研究不應該僅局限于miRNAs，還應涉及包括長鏈非編碼RNA在內的其他核酸及蛋白質和脂質標記物。關于EVs生物標記物的提取、鑒定和處理分析方面的挑戰仍然存在，充分利用現有的不同提取技術并對這些技術的優化是下一步研究的重要方向。

以EVs為媒介進行信息傳遞并干預肝臟疾病進程還存在許多問題：(1)在EVs用于人體治療之前，EVs的標準化和質量控制將必須考慮到工業生產及監管的標準，同時還要兼顧大規模生產的制造成本；(2)因為EVs的內容物不同于親代細胞的類型和狀態，對所提供外泌體類型的選擇將至關重要，應根據受體細胞的類型和目標分子進行篩選；(3)雖然臨床試驗已經證明自體EVs在重復使用后仍有很好的耐受性，但EVs在肝臟疾病臨床治療的效果依然缺乏隨機對照試驗的評價，此外EVs介導的信號轉導在肝臟疾病發生和發展中的相關性研究也須證明其有獨特的治療靶點。

綜上所述，EVs含有多種功能性生物大分子，包括蛋白質、核酸和脂類等，在肝臟不同細胞間的傳遞信息過程中具有舉足輕重的作用。EVs可以通過激活受體細胞中不同的信號通路來改變其功能，從而對各種肝臟疾病的發生和進展機制產生影響。體液中的EVs正在發展為一種潛在的肝病生物學標志物與治療監測的新手段。此外，在不久的將來，EVs也許會成為一種治療各種肝臟疾病的新方法。

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