細胞焦亡信號轉導機制及其在腎臟疾病發病中作用的研究進展

劉建銘，曹靈

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

既往研究認為，細胞死亡的方式包括壞死、凋亡和自噬等。而細胞焦亡(pyroptosis)是一種新發現的、不同于凋亡的程序性細胞死亡方式，其主要特征為依賴于炎性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)、細胞腫脹破裂、炎性因子外釋引起炎癥級聯反應等，是對刺激因素一種過度的應答反應，其最終結果是造成了細胞的損傷。細胞焦亡信號轉導途徑可分為經典的Caspase-1依賴的細胞焦亡途徑和非Caspase-1依賴的細胞焦亡途徑。研究發現，細胞焦亡廣泛參與中樞神經系統疾病、心血管系統疾病、腎臟疾病的發生發展。目前研究表明，細胞焦亡參與了多種腎臟疾病的發生發展，包括缺血再灌注腎損傷、糖尿病腎病、腎纖維化、晶體相關性腎病等。本文就細胞焦亡信號傳導機制及細胞焦亡與腎臟疾病的研究進展進行概述。

1 細胞焦亡的定義及與細胞凋亡的區別

1.1 細胞焦亡的定義 細胞焦亡是一種促炎性程序性死亡方式。1992年Zychlinsky等[1]研究發現，福氏志賀菌可使感染的巨噬細胞發生程序性死亡，因其與凋亡有些共同的特征，如核固縮、Caspase依賴等，當時被認為是凋亡，但不同的是凋亡是Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9依賴的，而這種細胞死亡方式后來被證實是Caspase-1依賴的。1998年Hubert等[2]用福氏志賀菌感染Caspase-1基因敲除巨噬細胞，發現不會誘發細胞死亡。因此認為Caspase-1在這種細胞死亡方式中起著重要的作用。2001年Cookson等[3]首次以“細胞焦亡”來命名這種依賴于Caspase-1的程序性細胞死亡方式。

細胞焦亡可由多種內源及外源危險因素所觸發，包括Caspase-1依賴的經典細胞焦亡途徑和非Caspase-1依賴的細胞焦亡途徑。前者途徑中，Caspase-1前體首先被募集激活，活化的Caspase-1再激活下游IL-1β和IL-18前體，同時Caspase-1的激活也會切割GasderminD膜蛋白(GSDMD)，使細胞膜破裂，炎癥因子(IL-1β、IL-18)、溶酶體等細胞內容物釋放，從而導致炎癥級聯反應；而后者途徑中，則由Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11識別革蘭陰性菌脂多糖(LPS)，再啟動下游細胞焦亡信號通路。

1.2 細胞焦亡與細胞凋亡的區別 細胞焦亡與細胞凋亡均屬于Caspase依賴的程序性細胞死亡方式，但兩者在發生機制、細胞形態學改變等方面有明顯的區別。①Caspase可引發細胞凋亡和細胞焦亡，但參與凋亡和焦亡信號通路的Caspase不同，凋亡相關的Caspase包括應答Caspase(Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10)和下游的效應Caspase(Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7)，而細胞焦亡相關的Caspase則為Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11；②焦亡細胞的細胞膜可形成直徑1.1～2.4 nm的微孔，離子以及水分子等小分子進入細胞內導致細胞腫脹破裂，使炎性因子和溶酶體等內容物釋放，引起炎癥級聯反應，相反凋亡細胞的細胞膜保持完整，其整個凋亡過程是非炎性的；③焦亡細胞也可出現染色質固縮，但其細胞核仍保持完整，焦亡細胞也可發生DNA損傷和TUNEL染色陽性，但與凋亡細胞相比其密度更低，其機制與細胞凋亡不同，凋亡細胞DNA損傷依賴于Caspase激活的DNA酶(CAD)，然而焦亡細胞的CAD仍結合于CAD的抑制因子ICAD，且DNA損傷并不是細胞破裂、降解的關鍵事件，因為阻斷DNA損傷仍然可以發生細胞焦亡[4]。

2 細胞焦亡的信號傳導機制

細胞焦亡途徑分為經典的Caspase-1依賴的細胞焦亡途徑和非Caspase-1依賴的細胞焦亡途徑，非Caspase-1依賴的細胞焦亡途徑由人源的Caspase-4、Caspase-5和鼠源的Caspase-11所介導，兩種途徑細胞的形態學改變相似。Caspase-1依賴的細胞焦亡途徑主要包括炎性小體的組裝、Caspase-1前體的激活、炎性因子(IL-1β、IL-18)的活化和效應分子GSDMD的裂解三個主要步驟，最終導致了細胞腫脹破裂、炎性因子釋放等生物學效應。

2.1 經典細胞焦亡路徑

2.1.1 炎性體的組裝是細胞焦亡的起始 炎性體是細胞內大分子蛋白復合體，其在細胞內的主要作用是抵抗細菌、病毒等感染因素對細胞的損傷。炎性體主要由模式識別受體(PRRs)、Caspase-1前體、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)組成。PRRs可識別細菌、病毒等外源性微生物攜帶的病原相關分子模式(PAMPs)和細胞內源性損傷所釋放的危險相關分子模式(DAMPs)，PRRs主要分為兩大類：第一大類包括跨膜的Toll樣受體(TLRs)和C型凝集素受體(CLRs)；第二大類包括定位于細胞內的RIG-I樣受體(RLR)、黑素瘤缺乏因子2受體(ALR)、NOD樣受體(NLRs)和γ干擾素誘導蛋白16(IFI16)蛋白，其中ALR與IFI16同屬于PYHIN家族蛋白成員，也被稱作HIN200蛋白家族[5]。目前研究發現，人類NLRs家族有22個成員，鼠源的NLRs家族有34個成員，2002年首次發現NLRP1可組裝為炎性體復合物，其后逐漸發現了NLR家族成員NLRP3、NLRC4和PYHIN蛋白家族成員AIM2以及TRIM家族成員Pyrin也可以組裝為炎性體復合物，同時越來越多的證據表明人源的NLRP2、NLRP7、IFI16和鼠源的NLRP6、NLRP12、IFI16也可以募集并激活Caspase-1前體，活化后的Caspase-1再激活下游相關細胞焦亡因子，因此炎性體復合物的組裝是焦亡起始關鍵環節[6]。

2.1.2 下游Caspase-1前體的活化 NLRs蛋白家族成員主要包括NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRP6、NLRC4、NLRP12等，其分子結構都包括位于中間的中央核苷酸結合寡聚化結構域(NACTH)、羧基末端亮氨酸重復區(LRR)、N端的熱蛋白結構域(PYD)或Caspase募集激活結構域(CARD)，人源的NLRP1包括N端的PYD結構域和C端的CARD結構域，而NRC4包括CARD結構域而無PYD結構域。黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)和IFI16分子結構包括N端的PYD結構域和C端的結合配體的造血干擾素誘導核蛋白結構域(HIN200)[11]。Pyrin蛋白同樣包括PYD結構域。ASC是Caspase-1的銜接蛋白，其結構包括N端的PYD結構域和C端的CARD結構域。

NLRs C端亮氨酸重復區(LRR)參與自身抑制，其主要功能是識別配體傳遞信號，中間的NACTH結構域參與炎性體組裝過程中的同源或異源寡聚化的調節。NLRs被相關危險因子識別后可通過其N端的PYD結構域，與含有PYD結構域的ASC結合，從而間接募集激活Caspase-1前體，而NLRP1、NLRC4可直接利用其自身的CARD結構域募集并激活Caspase-1前體[7]。AIM2的HIN200結構域結合胞質dsDNA，而IFI16既能感受胞質dsDNA也能感受胞核dsDNA，被dsDNA識別活化的AIM2和IFI16可通過其PYD結構域與ASC的PYD結構域結合，再通過ASC的CARD結構域募集激活下游的Caspase-1前體[8]。磷酸化的Pyrin與14-3-3蛋白結合而處于失活狀態，14-3-3蛋白以同源/異源二聚體形式存在，其主要功能是結合磷酸化蛋白的絲氨酸和蘇氨酸，從而影響靶蛋白的結構、功能。當受到細菌毒素刺激時可使RhoA失活，Pyrin去磷酸化，去磷酸化的Pyrin與14-3-3蛋白分離，從而使CARD結構域得以激活Caspase-1，誘導細胞焦亡[9]。

2.1.3 GSDMD是細胞焦亡的關鍵效應分子 炎性體可通過剪切活化Caspase-1前體，從而激活下游的IL-1β、IL-18，但Caspase-1及IL-1β等如何導致焦亡目前仍不完全清楚。2015年Shi等[10]用CRISPR/Caspase-9基因組編輯技術，對Caspase-1和Caspase-11介導的小鼠巨噬細胞焦亡通路進行了全基因組范圍遺傳篩選，發現GSDMD蛋白可能為炎性Caspase的效應分子。Gsdermn蛋白家族成員包括GSDMD、GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDME(DFN5)和DFNB59。人類GSDMD蛋白的N端由242個氨基酸組成，C端由199個氨基酸組成，其N端與C端通過一個含有43個氨基酸的結構連接起來。未受焦亡信號刺激的細胞其完整的GSDMD分子的N端結構域和C端結構域可相互作用，表現出自身抑制現象，當炎性Caspase切割GSDMD蛋白的N端和C端的連接結構時，就會解除GSDMD的自身抑制作用，其N端結構域即可遷移至細胞膜位置，與細胞膜膜磷脂、磷酸肌醇和雙磷脂酰甘油結合，且大約16個N端結構域單體寡聚化從而使細胞膜形成直徑為10～14 nm的微孔，鈉離子及水分子內流，鉀離子外流，細胞腫脹、破裂，胞質內容物及炎性因子釋放，導致炎癥級聯反應[11]。Shi等[10]也發現GSDMD缺陷的巨噬細胞不會影響IL-1β/18的成熟，但會影響其釋放，說明GSDMD蛋白導致的細胞孔洞形成，是IL-1β/18外釋的必要條件。

2.2 非經典細胞焦亡路徑 研究發現，生物界不僅存在經典的細胞焦亡路徑，也存在非經典的細胞焦亡路徑，其由人源的Caspase-4、Caspase-5及鼠源的Caspase-11所介導。Baker等[12]發現Caspase-4、Caspase-5在LPS誘導的人巨噬細胞焦亡中起著重要的作用。與經典途徑不同的是，細菌脂多糖并不是通過模式識別受體與ASC、Caspase前體組裝成復合物活化Caspase前體，而是直接結合Caspase4、Caspase-5、Caspase-11的CARD結構域，進而活化Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11。另一處不同的是，Caspase-4、Caspase-5不能直接切割并激活IL-1β、IL-18前體，而依賴于NRLP3、Caspase-1、ASC、K+外流。2015年Schmidbrgk等[13]在Caspase-4介導的人單核細胞焦亡中發現，NLRP3的激活依賴于細胞內K+的外流。同年Yang等[14]發現，細菌LPS誘導的Caspase-11活化可切割縫隙連接蛋白1通道(pannexin-1)，從而導致ATP釋放，進而開放膜通道P2X7。在ATP長時、反復刺激下，P2X7可以開放離子通道以促進K+的外流及Na+、Ca2+內流，破壞了細胞膜完整性。同時Pannexin-1通道裂解可以激活K+通道使K+外流，K+的外流再激活NLRP3，NLRP3激活后通過ASC募集激活Caspase-1，活化的Caspase-1再剪切激活IL-1β/18前體，誘導細胞焦亡[15]。2015年Shi等[10]發現，GSDMD同樣參與細菌LPS誘導的非經典細胞焦亡，同時發現Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11可直接切割GSDMD蛋白，其N端結構域可損傷細胞膜，機制類似于經典途徑細胞焦亡。

因此細菌LPS直接結合Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11的CARD結構域并激活Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11，活化的Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11一方面通過切割Pannexin-1導致ATP釋放，激活P2X7膜通道，破壞細胞膜完整性，使細胞內K+外流，激活NLRP3參與到IL-1β的釋放及Caspase-1的活化。另一方面活化的Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11可直接切割GSDMD，暴露其N端結構功能域，使細胞膜形成微孔，膜通透性發生改變，細胞腫脹、破裂，誘導細胞焦亡。

3 細胞焦亡與腎臟疾病的關系

3.1 細胞焦亡與缺血再灌注腎損傷 急性腎損傷是一種由多種原因導致的急性腎小管上皮細胞死亡，而腎臟缺血再灌注是導致急性腎損傷的一個主要原因。目前研究發現，除凋亡和壞死等傳統的細胞死亡方式外，細胞焦亡在缺血再灌注腎損傷中也起著重要的作用。2013年Yang等[16]在小鼠腎臟缺血再灌注模型中發現，Caspase-1、Caspase-11、IL-1β等焦亡相關蛋白表達增加。在NRK-52E細胞缺氧復氧模型中發現了細胞孔洞的形成及乳酸脫氫酶的釋放，進一步研究發現，在缺血再灌注/缺氧復氧發生前，內質網應激的標志物C/EBP同源蛋白(CHOP)表達量增加，以siRNA沉默CHOP基因可顯著減少NRK-52E細胞的焦亡，Caspase-11、IL-1β的生成也減少，表明內質網應激參與了缺血再灌注腎小管上皮細胞的焦亡。2016年陳雨等[17]研究發現，缺血再灌注/缺氧復氧上調了腎小管上皮細胞動力相關蛋白1(Drpl)，Drp1過表達使線粒體結構與功能發生改變，從而產生大量活性氧，線粒體來源的活性氧可激活NLRP3及下游焦亡相關因子，導致細胞焦亡，而抑制Drp1的表達可使焦亡細胞明顯減少，因此線粒體功能障礙在缺血再灌注損傷細胞焦亡中起著重要的作用。

3.2 細胞焦亡與糖尿病腎病 糖尿病腎病是一種常見的腎臟疾病，是導致終末期腎病(ESRD)的主要原因之一。細胞焦亡是一種促炎性的細胞死亡方式，其在糖尿病腎病的發生發展中起著重要作用。高血糖狀態下機體可生成多種危險相關分子如脂肪酸、活性氧等，可被相關的PRRs所識別，從而啟動細胞焦亡[18]。Xue等[19]研究發現，長鏈非編碼RNA MALAT1參與了糖尿病腎病腎小管上皮細胞的焦亡過程。MALAT1抑制了mir-23c的表達，mir-23c的下調促進了其靶基因ELAVL1的表達，ELAVL1是一種細胞焦亡相關蛋白，ELAVL1表達增加后可促進下游NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-1的生成，最終導致腎臟炎癥反應和細胞焦亡。李嶸等[20]研究發現，mi-497可通過直接靶向抑制NLRP1的表達，從而減少IL-1β、Caspase-1等焦亡相關因子的表達，抑制高糖和胰島素誘導的系膜細胞焦亡。由此可見，長鏈非編碼RNA及microRNA可調控高糖誘導的腎小管上皮細胞的焦亡，而調控細胞焦亡的其他分子機制仍有待進一步研究。

3.3 細胞焦亡與腎纖維化 腎臟纖維化是多種腎臟疾病進展至ERSD的最終途徑。已有研究表明，TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、JAK/STAT等多種信號通路參與了腎臟纖維化的進展。近年來研究發現，細胞焦亡同樣參與了腎臟纖維化的發生發展，Guo等[21]研究發現NLRP3基因敲除的UUO小鼠與野生型相比，其活化的Casapse-1/IL-18/IL-1β明顯減少，且腎小球的損傷及小管間質纖維化明顯減輕。梁文杰[22]研究發現，化淤解毒中藥可通過抑制UUO大鼠NF-κB的激活使NLRP3、IL-18/IL-1β前體生成減少，因而抑制了NLRP3/Caspase-1/IL-18/IL-1β軸的激活。由此可見，細胞焦亡在腎臟纖維化的進展中起著重要的作用，對焦亡通路及調控機制的進一步研究有助于延緩腎臟纖維化進展。

3.4 細胞焦亡與晶體相關性腎病 晶體相關性腎病是指由草酸鈣、尿酸結晶等大量沉積于腎小管導致的急性腎損傷、慢性腎臟疾病、腎結石等腎臟疾病。目前研究認為，結晶狀物質沉積于腎小管導致腎功能損害主要原因之一是，大量結晶堵塞腎小管導致腎小囊內壓增加，腎臟積水等使腎小球濾過率下降，腎臟功能損傷；另外沉積于腎小管的晶體可以激活NLRP3炎性體及下游焦亡相關信號分子，致腎小管上皮細胞焦亡[18]。Mulay等[23]發現，在高草酸鈣飲食誘導的急性腎損傷小鼠中，樹突狀細胞可通過NLRP3/ASC/Caspase-1軸釋放IL-1β，而敲除NLRP3/ASC/Caspase-1的基因后，其腎小管損傷和炎癥反應有所減輕。Xiao等[24]以含100 μg/mL尿酸培養液培養腎小管上皮細胞發現TLR4、NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達的增加，予以TLR4的阻滯劑TAK242干預后NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表達明顯減少，說明尿酸可通過TLR4激活NLRP3及下游焦亡信號因子，導致腎臟炎癥反應及細胞焦亡。以上研究表明，干預細胞焦亡通路可減輕晶體相關性腎損傷。

4 結語

細胞焦亡是新發現的一種程序性細胞死亡方式，內源性和外源性刺激因子可通過經典焦亡路徑與非經典路徑激活焦亡信號通路參與多種腎臟疾病的發生發展，NLRP3、Caspase-1、IL-18/IL-1β是腎臟細胞焦亡路徑的關鍵因子。但目前對于細胞焦亡參與腎臟疾病的相關分子機制及調控機制研究尚較少，對細胞焦亡參與腎臟疾病進行更加深入的研究，有助于進一步揭示其參與腎臟疾病的分子機制，為研發特異性阻斷腎臟疾病進展的藥物提供理論依據。