巨噬細胞表型轉換及其在腎缺血再灌注損傷中作用的研究進展

樊雪梅，容松

(遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563003)

腎移植術是治療腎功能衰竭的重要方法。但移植后仍面臨著與腎缺血再灌注損傷(RIRI)相關的術后感染、腎功能恢復延遲、移植腎失功能等難題，對短期和長期移植結果有重要影響[1,2]。巨噬細胞是極具異質性和可塑性的免疫細胞之一，研究發現，巨噬細胞與RIRI密切相關，在RIRI過程中發揮抗炎和促炎的雙重作用。多種無菌缺血性腎損傷模型實驗已證實，巨噬細胞參與了RIRI過程的所有階段，包括初始損傷、后續修復及晚期纖維化。我們以巨噬細胞為切入點，對其表型轉換及其參與RIRI機制的相關研究進行綜述。

1 巨噬細胞的起源和異質性

巨噬細胞在固有免疫、惡性腫瘤、代謝和繁殖等系統起關鍵作用，并以浸潤巨噬細胞及組織固有巨噬細胞兩種形式存在于體內[1]。前者由骨髓來源的未成熟單核細胞進入血液循環后移行至各組織分化而來，后者則廣泛分布于全身各組織，因定居組織不同而命名不同，如分布在肝臟者稱為Kupffer細胞，分布在皮膚者稱為Langerhans細胞，分布在大腦者稱為小膠質細胞。目前認為固有巨噬細胞有三種來源，由血液中造血前體細胞在組織局部分化而來[2]、源于卵黃囊[3]及源于胎肝組織[4]。自發現巨噬細胞以來，探索其在各種病理機制中發揮何種作用一度成為研究熱點。大量研究已證實，巨噬細胞具有可塑性和異質性[5]，被作為單核細胞-巨噬細胞譜系的標志。巨噬細胞具有多樣性轉錄譜，可極化為不同亞型以響應微環境的動態變化，從而發揮不同的功能。

2 巨噬細胞的分型、表型轉換及功能

目前多數文獻將巨噬細胞分為M1、M2兩類亞型：經典活化的巨噬細胞(M1)和替代活化的巨噬細胞(M2)。巨噬細胞在干擾素(IFN)、Toll樣受體等信號刺激下發生表型轉換，極化為M1，在IL-4、IL-13等信號刺激下極化為M2，二者的平衡狀態與腎臟微環境相關，可能與巨噬細胞源性轉化生長因子-β(TGF-β)抑制誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)、刺激精氨酸酶(Arg)及信號轉導和轉錄激活(STAT)、NF-κB等信號通路的調節有關。然而，有學者提出M1/M2分型方法并不嚴謹，M1、M2是巨噬細胞在不同微環境因素刺激下發生表型轉換這一動態過程的兩個極端，該分型方法并不能反映該過程的真實性。

多項研究表明巨噬細胞發生表型轉換是復雜連續的過程，并非直接由M1轉變到M2。如：M2三種附加亞型的研究(М2a由IL-4、IL-13等誘導，發揮組織修復作用；M2b由免疫復合物等誘導，發揮免疫調節作用；M2c由IL-10、TGF-β等誘導，發揮抗炎作用)；Mantovani等[6]認為M2樣巨噬細胞具有M2的部分表型特征而非全部特征；Malyshev等[7]提出體內尚不存在純粹的只表達M1或M2表面標記物的巨噬細胞，且發現巨噬細胞除M1、M2表型外，還存在新的表型——M3轉換表型[7]?？梢?，巨噬細胞的具體分型、表型轉換等仍需更深入的研究。但目前廣泛使用的是M1/M2分型方法，因其簡化了巨噬細胞表型轉換的復雜性，便于研究中的描述。

M1、M2的表面標記物也尚未統一。TLR-4、MARCO受體、CD25、CD80可作為M1的表型特征，甘露糖受體、CD163、CD209等可作為M2的表型特征。Sun等[8]報道CD16、IL-1R、IL-12等可為M1的表面標記，通過釋放IL-6、TNF-α、IL-1、ROS、iNOS、等炎性細胞因子及CXCL5、CXCL9等趨化因子以招募其他免疫細胞，發揮促炎作用；IL-1R(M2a)、CD86(M2b)、CD150、CD163(M2c)可為M2各類附加亞型的表面標記，釋放IL-10、IL-12、TGF-β、Arg-1等因子，發揮抗炎、修復、促纖維化等作用。李康等[9]認為，iNOS、IL-12、CDl6/32可用于鑒定M1；Arg-1、CD206、Dectin-1可用于鑒定M2。探究巨噬細胞表面標記物，以鑒定巨噬細胞亞型是研究其在病理過程中發揮何種功能的重中之重。

關于M1、M2功能的研究已取得一定成果。Gordon等[10]認為，M1可清除入侵微生物及腫瘤細胞并促進Ⅰ型免疫反應，參與初始炎癥反應；M2則主要參與碎片清除、血管生成、組織重塑及傷口愈合并促進Ⅱ型免疫反應，在炎癥后期發揮重要作用。簡言之，M1在組織損傷中發揮促炎作用，M2則參與抗炎、組織修復及纖維化。

3 巨噬細胞在RIRI中的作用

3.1 巨噬細胞促進RIRI的炎癥反應 RIRI動物模型實驗證實，受損腎小管和內皮細胞可分泌單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、基質細胞衍生因子-1、IL-6和IL-8等趨化因子及炎性細胞因子，引導巨噬細胞、淋巴細胞等向腎間質快速浸潤[11]。巨噬細胞等免疫細胞通過其模式識別受體，識別病原體相關分子模式和損傷相關分子模式(DAMPs)，以介導炎癥反應。RIRI發生時，缺血受損的腎組織釋放大量DAMPs[12]，如高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、熱休克蛋白(HSPs)等，這些DAMPs與巨噬細胞表面受體結合(如Toll樣受體TLRs)，激活巨噬細胞，引發非感染性炎癥，促進腎組織損傷[2,13]，此期促炎性巨噬細胞占主導地位，腎小管細胞凋亡顯著。Mulay等[14]認為炎癥與腎臟損傷在自動放大循環中相互增強，細胞損傷釋放DAMP等可通過TLRs激活浸潤單核細胞為促炎表型，浸潤活化的促炎性巨噬細胞又進一步分泌多種促炎細胞因子，導致壞死性炎癥，而抑制這類巨噬細胞可減輕甚至阻止受損腎免疫病理學的進展。

RIRI發生后，巨噬細胞是嚙齒類動物腎小管周圍聚集的主要細胞類型之一。研究發現，使用脂質體氯膦酸鹽(LC)使巨噬細胞減少或缺失，可減輕腎形態學損傷及減少尿素氮和肌酐的增加，抑制細胞因子、預防或消耗巨噬細胞等炎性細胞歸巢，可降低模型形態和功能的損傷。損傷腎中的巨噬細胞經歷從M1到M2表型轉換的動態變化。M1產生活性氧、氮中間體等效應分子，IL-1β、TNF、IL-6、IL-12等炎性因子及MCP-1、CCL2、CXCL10、CXCL11等趨化因子促進組織損傷，同時還高表達iNOS，以分解L-精氨酸為瓜氨酸和NO，NO的大量聚集可致組織損傷[15,16]。Inoue等[17]新近的研究認為，M1表達巨噬細胞誘導的C型凝集素(Mincle)可介導腎急性期損傷，Mincle的表達受TLR4/NF-κB信號傳導調節，它通過酪氨酸激酶(Syk)/ NF-κB信號通路維持M1的炎性表型，促進iNOS、MCP-1、TNF-α等炎性因子的產生，最終導致腎損傷，而抑制Mincle的表達則有腎保護作用。因此，控制RIRI中M1介導的炎性反應，可為移植腎存活提供良好的微環境，是腎移植領域值得努力的方向。

3.2 巨噬細胞參與RIRI的修復 RIRI時腎小管受損，管狀細胞顯著增殖，修復過程即啟動，于第3天達峰值，隨后1周內緩慢下降。在此修復期研究中發現，巨噬細胞經歷了表型變化并發揮著保護和修復作用。Lin等[18]研究發現，巨噬細胞缺乏時腎上皮細胞中典型的Wnt通路反應減少，腎修復大大減弱；使用Wnt途徑調節劑后修復增強，表明巨噬細胞源性Wnt7b(Wnt通路配體)在修復和刺激腎上皮細胞再生中起重要作用，印證了巨噬細胞參與受損腎的修復過程。進一步追蹤熒光標記的促炎性M1實驗發現，修復期腎中的 M1可轉換為M2，巨噬細胞經歷了促小管炎癥損傷到支持小管修復的表型轉換。相似地，Cao等[19]認為 RIRI后M2可刺激腎小管上皮細胞在內的多種細胞增生，這可能與M2抑制M1、減少促炎因子及iNOS的產生有關。M2還可表達高水平Arg-1、甘露糖受體(MR)及IL-10等[20,21]，Arg可與 iNOS競爭性結合同一底物L-精氨酸，將其裂解為脯氨酸和多胺，促進細胞分裂和膠原形成，從而發揮其促修復作用，另外，多胺又可促進巨噬細胞向M2轉換，進一步對損傷組織進行修復和重塑。IL-10是公認的內源性抗炎因子代表之一，主要來源于巨噬細胞和Th細胞，也可以由損傷腎小管上皮細胞產生，一定濃度的IL-10可抑制 MCP-1、IL-2、INF-γ、IL-8、IL-1、TNF-α等炎性因子的產生，發揮其抗炎促修復作用[22]。在RIRI修復期，用LC敲除小鼠巨噬細胞后可使小鼠腎損傷加重，表明此期的巨噬細胞發揮腎臟保護作用與其高表達IL-10及抑制TNF-α分泌有關[23]。此外，Huen等[24]研究發現，體巨噬細胞修復表型的激活機制與腎近端小管細胞分泌的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF，一種STAT5的激活劑)上調相關，GM-CSF受到STAT5通路的調節，而體內、體外GM-CSF功能的阻斷性實驗也證實該阻斷可減弱巨噬細胞的替代激活，導致修復期腎小管細胞增殖減少。盡管巨噬細胞誘導腎臟修復的具體機制仍在爭論中，但隨著研究的不斷深入，已確定可增加有益因子的釋放、阻斷損傷表型激活通路、促進修復表型激活通路、控制炎性環境、保持M2表型穩定等，因此以M2為基礎的細胞療法仍然值得期待。

3.3 巨噬細胞參與RIRI后的纖維化 持續的炎癥反應是RIRI后慢性腎臟疾病發生的重要原因，包括巨噬細胞在內的多種炎癥細胞、炎癥因子參與受損腎組織的纖維化。通過抗巨噬細胞血清或LC消除巨噬細胞可減少持續性炎癥及隨后的纖維化發展。實驗研究表明，巨噬細胞可刺激和釋放TGF-β1、MCP-1、血小板源生長因子(PDGF)、IL-l等促纖維化因子，這些因子不僅可誘導腎臟某些固有細胞(如腎間質成纖維細胞、腎小管上皮細胞等)活化為成肌纖維細胞(可合成細胞外基質而促進腎臟纖維化)，還可抑制細胞外基質降解酶，加快腎纖維化[25]。TGF-β1是腎纖維化的關鍵調節因子及公認的腎纖維化指標之一，不僅可誘導成肌纖維細胞通過Smad 信號通路促進細胞外基質形成，還能通過減少基質金屬蛋白酶等促進細胞外基質降解，進一步加重纖維化進展。此外，TGF-β1還可直接促進膠原的合成。巨噬細胞在一定刺激下(如LPS、IL-1、IFN-γ、某些病毒)高表達MCP-1，MCP-1又可直接趨化巨噬細胞進入受損組織，該相互作用導致二者在組織大量聚集和累積，使腎臟炎癥持續。持續的M2浸潤可能導致某些傷口愈合生長因子的持續產生，最初的組織修復機制可能進展為有害的纖維化。因此巨噬細胞也被認為是導致腎纖維化的重要因素，控制巨噬細胞活化和浸潤能預防RIRI后腎纖維化的發展。

4 巨噬細胞在RIRI中的研究方向

巨噬細胞具有可塑性、異質性，廣義上根據不同微環境刺激情況被分為經典活化的M1型和替代活化的M2型，分別在組織損傷中發揮促炎和抗炎及促纖維化作用。但目前根據刺激物不同，對巨噬細胞亞型進行分類的方法值得我們深思：活體微環境中通常有多種刺激因子同時存在，共同影響著巨噬細胞，此時巨噬細胞會向哪一種表型轉換？此時仍根據刺激因子類型來區分巨噬細胞亞型及M2附加亞型是否合理？可見，對巨噬細胞分型及表型轉換的研究仍任重道遠。不論巨噬細胞如何分型、如何發生表型轉換，其在病理過程中發揮損傷與修復的雙向作用是明確的，這使我們對以巨噬細胞為基礎的細胞療法有了信心，進一步研究誘導巨噬細胞向有益表型轉換并使之保持穩定，調控甚至阻斷其向有害表型轉換，這也是以巨噬細胞為基礎的、更好地提高臨床器官移植成功率、存活率的研究方向。目前的研究已證實，巨噬細胞可轉換為M2修復表型，這些成果使輸注M2及其相關因子用于治療腎臟疾病的方法成為可能，且已有諸多動物實驗證實輸注M2a、M2c等細胞對動物模型的治療作用。

但我們也面臨著挑戰，例如巨噬細胞的許多中間表型可能共存于同一組織中，對其極化和不同表型功能機制的研究尚不透徹，如何在保證誘導修復表型的同時，阻斷其他有害表型的極化尚不明確；修復表型的引入是否會帶來組織細胞惡性增殖的威脅及過度修復以致纖維化尚不明確；人類RIRI的治療中，如何得到純合且表型保持穩定的M2，同時如何把握輸注時機、劑量尚不明確。因此，在缺乏關于人類巨噬細胞類型及其可塑性、功能型的研究背景下，基于巨噬細胞的細胞療法在用于人類之前仍需大量臨床研究的支持。