飛行時間質(zhì)譜技術鑒定絲狀真菌的研究進展

張敬霞，曲 芬

侵襲性真菌感染是重癥監(jiān)護和器官移植患者死亡的高風險因素[1]，其早期診治對提高救治率至關重要。其中，絲狀真菌是侵襲性真菌感染的主要病原菌之一，但絲狀真菌生長緩慢（一般需要5～7 d）限制了早期診斷[2-3]，絲狀真菌的早期鑒定與耐藥性增強已成為臨床救治的重大難題[4]。目前，絲狀真菌常用的鑒定方法為鏡檢和菌落形態(tài)聯(lián)合鑒定，但不足之處是易受檢驗人員主觀判斷影響。分子生物學方法雖是“金標準”，但其操作繁瑣且對實驗室條件和操作人員的技術水平要求較高，不適合常規(guī)開展[2]。基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser-desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）技術可以通過檢測真菌中固有的特異性蛋白形成的特征性圖譜從而實現(xiàn)對真菌菌種快速、準確的鑒定[5-7]，對于指導臨床抗生素使用非常重要[3]。本文從技術原理、標本前處理、鑒定效果及影響因素等方面對MALDITOF MS技術鑒定絲狀真菌的研究進展作一綜述。

1 MALDI-TOF MS技術的鑒定原理

MALDI-TOF MS技術是近幾年發(fā)展起來的，用于臨床分離病原菌全細胞鑒定的軟電離技術，其主要是針對菌種特異性核糖體蛋白進行檢測，具有操作簡單、快速、準確等優(yōu)點。MALDI-TOF MS主要由MALDI和TOF兩部分組成。MALDI技術的工作原理：激光照射樣品蛋白與過飽和的基質(zhì)溶液形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量并與樣品蛋白解吸附使樣品電離，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，從而使生物分子電離。TOF的工作原理：不同質(zhì)荷比（m/z）的離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達檢測器的時間不同，獲得細菌特異的質(zhì)譜指紋峰圖。將該峰圖與標準數(shù)據(jù)庫圖譜進行比對，根據(jù)匹配結(jié)果進行判讀。分值越高，匹配效果越好，準確度越高。鑒定結(jié)果的評分范圍0～3.0，數(shù)值＞2.0表明鑒定結(jié)果可達到菌種水平，1.7～2.0表明鑒定結(jié)果僅達到菌屬水平，＜1.7為未達到菌屬水平，結(jié)果不可信。由于微生物菌種或菌屬存在不同程度的種內(nèi)差異，如核苷酸順序、生化反應、指紋圖譜類型等，因此，數(shù)據(jù)庫指紋圖譜應該足夠全面以確保覆蓋菌種內(nèi)的天然差異。

2 MALDI-TOF MS技術鑒定絲狀真菌的前處理

絲狀真菌的鑒定準確性較差，且由于細胞壁厚和形態(tài)特征變化大，診斷方法一直難以突破[2]。MALDI-TOF MS技術鑒定絲狀真菌基本步驟包括點靶、前處理、上機，其中難度最大的是絲狀真菌的前處理，即破壁。前處理也是影響絲狀真菌鑒定效果的主要因素。絲狀真菌細胞壁厚，為100～200 nm，且細胞壁的韌性和穩(wěn)定性都較強，普通的前處理方式難以奏效。Vermeulen等[8]分析了MALDI-TOF MS技術鑒定完整絲狀真菌細胞和裂解后細胞的效果，結(jié)果顯示，細胞裂解法明顯優(yōu)于完整細胞法。

De Carolis等[9]通過對103株絲狀真菌（曲霉菌、鐮刀菌、毛霉目菌）運用真菌孢子和水混合直接點靶的完整細胞法處理，使用MALDI-TOF MS技術進行鑒定，發(fā)現(xiàn)94株已知菌中，91株能鑒定到菌種水平。同樣，Nenoff等[10]使用完整細胞法對285株皮膚真菌（紅色毛癬菌、毛孢子菌等）的研究顯示，78.2%的絲狀真菌可以鑒定到菌種水平。

細胞裂解法目前主要包括磁珠破碎法、海沙/丙酮-乙醇/甲酸乙腈提取法和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法等。磁珠破碎法的優(yōu)點在于可以對絲狀真菌充分研磨從而達到破壁效果，缺點在于操作比較繁瑣。2008年Hettick 等[11]運用磁珠破碎法對12株青霉菌樣本進行分析，結(jié)果顯示，該方法對青霉菌鑒定的準確率達到100%。此外，12株曲霉菌屬和5株不同的黃曲霉菌的鑒定結(jié)果表明其可以達到菌種水平的準確鑒定[12]。該方法具有很高的重復性，Lau等[13]采用磁珠破碎法對421株固體培養(yǎng)基上生長的絲狀真菌鑒定，結(jié)果顯示，菌種和菌屬的鑒定準確性分別達到370（88.9%）株和388（93.2%）株。

另外一種破壁的方式是甲酸乙腈前處理，也是臨床實驗室最常用的方法。 Schr?dl等[14]對41株不同的橫梗霉進行甲酸乙腈提取法處理，實現(xiàn)了在菌種水平100%的準確鑒定率。Bille等[15]在甲酸乙腈提取法的基礎上進行了簡化，將64株曲霉菌的孢子或菌絲與靶板上甲酸乙腈（1 μl 70%）預混后對細胞進行裂解，使用該裂解方法檢測準確率可以達到86%，與Iriart 等[16]應用甲酸乙腈提取法鑒定44株曲霉菌的效果（81.1%）相當，甲酸乙腈提取方法同樣適用于絲孢菌屬、鐮刀菌屬、橫梗霉菌屬和皮膚癬菌的鑒定[8，17]。

最后一種方式是旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法，該方法可以得到均一的菌絲體，有利于絲狀真菌細胞壁的破壞。黃艷飛等[18]運用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法對380株絲狀真菌培養(yǎng)鑒定，其鑒定菌屬和菌種的準確率分別為94.0%和76.0%。因此，實驗室在鑒定絲狀真菌時可以根據(jù)自身實驗室條件和實驗需要選擇合適的前處理方法，從而達到滿意的鑒定結(jié)果。

3 MALDI-TOF MS技術鑒定絲狀真菌的效果

近年來，MALDI-TOF MS技術對絲狀真菌快速鑒定的研究逐漸增加，鑒定的絲狀真菌種類也在增多。Ranque等[19]選取了58種共625株絲狀真菌（毛癬菌、鐮刀菌、木霉菌和毛霉目菌等），應用傳統(tǒng)方法和MALDI-TOF MS技術同時鑒定，菌種水平鑒定準確率分別為80%和89%。對于非曲霉類的絲狀真菌，MALDI-TOF MS技術的鑒定準確率較傳統(tǒng)方法提高了31%～61%。MALDITOF MS技術對以下絲狀真菌鑒定效果較好，包括曲霉菌、青霉菌、毛癬菌、鐮刀菌、木霉菌和毛霉目菌，其中對曲霉菌的鑒定效果最好，鑒定準確率可以達到98.4%[19]，與Bile等[15]的鑒定效果相當（98.4%）。Chen等[20]也使用MALDITOF MS技術成功識別了6種青霉菌屬菌株。De Carolis等[9]通過103株絲狀真菌（曲霉菌、鐮刀菌、毛霉目菌）質(zhì)譜鑒定對MALDI-TOF MS技術進行評估，發(fā)現(xiàn)94株已知菌中，91株能鑒定到菌種水平，其余3株鑒定到菌屬水平。

MALDI-TOF MS技術對少見絲狀真菌也可以達到較好的鑒定效果，Lau等[13]通過甲酸乙腈提取技術對421株固體培養(yǎng)基上生長的包括76個菌屬和152個菌種的絲狀真菌（其中涵蓋了少見絲狀真菌，包括莖點霉、尖端賽多孢、疣狀瓶霉、擔子類菌、球毛殼菌等）進行鑒定，然后在菌種水平鑒定出370株（88.9%），在菌屬水平鑒定出388株（92.2%），33株鑒定結(jié)果不可信，其中8株青霉菌不在菌種數(shù)據(jù)庫中，其余25株為與臨床疾病無關的擔子菌。因此，根據(jù)臨床需要，MALDI-TOF MS技術須要不斷擴充并完善質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。

4 MALDI-TOF MS技術鑒定絲狀真菌的影響因素

MALDI-TOF MS技術鑒定絲狀真菌的影響因素包括取材部位、指紋圖譜數(shù)據(jù)庫及提取方法等。

4.1 取材部位 根據(jù)絲狀真菌的菌落特征分為孢子和菌絲兩個部位，二者鑒定效果不同，由于絲狀真菌孢子細胞壁比較厚，孢子壁不易溶解導致蛋白析出困難[16]，因此絲狀真菌的鑒定最好選用菌絲部位。Welham等[21]在2000年首次報道了用MALDI-TOF MS技術鑒定青霉菌、雙間柱頂孢霉菌及紅色毛癬菌的孢子，由于真菌孢子破壁困難，結(jié)果僅獲取到少量波峰。同年Li等[22]對黃曲霉、米曲霉、寄生曲霉及醬油曲霉的孢子進行研究，結(jié)果表明產(chǎn)黃曲霉素菌株和非產(chǎn)黃曲霉素菌株具有不同的質(zhì)譜波峰圖，該方法同樣適用于曲霉菌、和鐮刀菌屬的鑒定[23-25]。菌絲部位細胞壁較孢子部位薄，破壁效果相對較好，Li等[26]對381株曲霉菌的菌絲進行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論分值如何變化，MALDI-TOF MS技術的鑒定準確率都可以達到89.0%。同樣，Lau等[13]對421株絲狀真菌的菌絲的研究中鑒定準確率也達到了93.2%。

4.2 指紋圖譜數(shù)據(jù)庫 MALDI-TOF MS技術中完整的真菌指紋圖譜數(shù)據(jù)庫是保證鑒定結(jié)果準確的基礎。值得注意的是，不同菌種之間甚至在同種真菌不同菌株之間，真菌細胞壁和孢子的組成也呈現(xiàn)出定性和定量的差異[11]。因此，鑒定結(jié)果取決于指紋圖譜數(shù)據(jù)庫中某一菌種的菌株數(shù)量，但De Carolis 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，臨床分離的絲狀真菌鑒定通常與數(shù)據(jù)庫中很少（或甚至1個）的參考圖譜比對。除了Bille等[15]和 Iriart等[16]運用了Andromas和Vitek MS數(shù)據(jù)庫進行鑒定外，其他研究者均在上述兩種數(shù)據(jù)庫基礎上對數(shù)據(jù)庫進行了擴增。鑒定錯誤的實驗研究往往是因為參考的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫不存在該菌質(zhì)譜指紋圖譜[8]。

此外，為了實現(xiàn)同種菌種不同菌齡的準確鑒定，Alanio 等[27]運用了一個由新生菌落和成熟菌落作為參考菌株的指紋圖譜，并建立了特定物種的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，然后用124株臨床曲霉菌和16株環(huán)境曲霉菌對指紋圖譜數(shù)據(jù)庫進行了測試，結(jié)果鑒定準確率達到了98.6%（138/140），特異度達到了100%，該數(shù)據(jù)庫可以鑒定不同成熟度的菌落。在Alanio研究的基礎上，De Carolis等[9]建立了一個大型的與臨床絲狀真菌相關的數(shù)據(jù)庫用于MALDI-TOF MS技術對物種的分析。數(shù)據(jù)庫的指紋圖譜來自于109株菌種的新生和成熟菌落，其中涵蓋了55種絲狀真菌（33種曲霉菌、12種鐮刀菌、10種毛霉目菌）。進一步用103株絲狀真菌評估這個數(shù)據(jù)庫，通過分子測序的方法對MALDI-TOF MS技術鑒定結(jié)果的可靠性進行評定。除了數(shù)據(jù)庫沒有包含的9株絲狀真菌外，MALDI-TOF MS技術對菌種水平的準確鑒定率達到了96.8%（91/94），其余3株僅鑒定到了菌屬的水平 。為了增加指紋圖譜數(shù)據(jù)庫中菌種的涵蓋面，Lau等[13]進一步建立了一個綜合性的數(shù)據(jù)庫（294株絲狀真菌分離株包括76個菌屬和152個菌種），當用421株臨床分離真菌來對這個數(shù)據(jù)庫進行評估時，數(shù)據(jù)達到了菌種水平和菌屬水平的精準鑒定，其鑒定準確率分別為370株（88.9%）和388株（93.2%）。

擴充數(shù)據(jù)的研究在近幾年逐漸增加，并且均取得了滿意的鑒定效果。2017年西班牙一個實驗室用390株曲霉菌對自建數(shù)據(jù)庫做了驗證分析，其中95.5%達到了菌種水平，4.5%達到了菌屬水平[28]。同樣，Triest等[29]在對自建數(shù)據(jù)庫的研究中獲得了91%的菌種鑒定率，因此，實驗室自建數(shù)據(jù)庫具有更好的特異性和準確性，不斷完善質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫是實現(xiàn)MALDI-TOF MS技術快速、準確鑒定絲狀真菌的有力保障。

4.3 提取方法 為了優(yōu)化MALDI-TOF MS技術對絲狀真菌的常規(guī)鑒定方法，Cassagne 等[30]制定了一個詳細的鑒定程序，用沙保弱-慶大-氯霉素瓊脂對絲狀真菌進行培養(yǎng)，用甲酸乙腈提取絲狀真菌菌落，絲狀真菌鑒定到菌種水平的準確率達到87%。鑒定失敗的菌株是由于數(shù)據(jù)庫中不存在對應的質(zhì)譜指紋圖譜，1株白僵菌未能鑒定出結(jié)果和1株米根霉菌錯誤鑒定成了卷枝毛霉菌。Coulibaly等[31]在對甲酸乙腈和三氟乙酸2種提取方法進行比對時發(fā)現(xiàn)甲酸乙腈提取效果和三氟乙酸的提取效果相似，但是甲酸乙腈提取法具有更快、毒性更小等優(yōu)點。Alanio 等[27]在之前的研究成果之上制定了一個簡單快速的鑒定方案：直接用絲狀真菌的孢子、分生孢子、菌絲混合在水中，然后將水混合物點靶。研究顯示，直接點靶技術也可以得到質(zhì)譜指紋圖譜[32]。Park等[33]在用甲酸乙腈提取蛋白的方法對345株曲霉菌鑒定的研究中，菌種的鑒定率達到了94.5%（326/345），菌屬鑒定率達到了98.8%（341/345）。雖然甲酸乙腈提取蛋白的實驗方法可以獲得較好的結(jié)果[13]，但是當?shù)鞍滋崛》椒ū粡V泛用于絲狀真菌質(zhì)譜鑒定的時候，顯現(xiàn)出一個重要的問題：孢子產(chǎn)生的氣溶膠會對實驗室產(chǎn)生潛在的感染或者污染，故整個活菌的操作過程必須在生物安全柜內(nèi)進行，且不能同時進行多種真菌的操作，以免交叉污染。

4.4 其他影響因素 為了獲得均一的菌絲從而得到更加清晰的質(zhì)譜圖譜，布魯克公司在建立單獨的絲狀真菌數(shù)據(jù)庫時采用了沙保弱液體培養(yǎng)基培養(yǎng)絲狀真菌[11]。雖然液體培養(yǎng)法減少了培養(yǎng)條件的影響并且可以獲得均一的菌絲體，同時也減少大多數(shù)菌種色素和次代謝物的產(chǎn)生[30]。但是該方法很少用于臨床真菌實驗室，因為它存在霧化孢子污染的風險以及無法顯現(xiàn)表型的宏觀和微觀特征[34]。

另外，液體培養(yǎng)難以檢測到污染或與其他霉菌共同的感染。固體培養(yǎng)絲狀真菌不僅在臨床真菌實驗室廣泛使用，而且易于檢測到污染。收集絲狀真菌樣本時，固體培養(yǎng)基比液體培養(yǎng)基在制備過程上更加簡化，節(jié)省時間[34-35]。評分標準對鑒定結(jié)果具有至關重要的作用，Li等[26]對381株的曲霉菌的研究發(fā)現(xiàn)，當菌種的評分臨界值從≥2.0改為≥1.7時，菌種鑒定率就從30.2%上升到了79.5%；因此，在鑒定曲霉菌的時候可以降低BURKER的評分標準。由于絲狀真菌的生長條件（時間、溫度、培養(yǎng)基）的改變會影響它的形態(tài)特征，因此，Zhou等[36]在52株煙曲霉的研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時間（48、72、96、120 h）對質(zhì)譜鑒定效果的影響具有統(tǒng)計學意義，其中培養(yǎng)48 h的鑒定效果較其他3組差。但研究發(fā)現(xiàn)無論是生長在沙保弱液體培養(yǎng)基、沙保弱瓊脂培養(yǎng)基還是Chalet瓊脂培養(yǎng)基的煙曲霉，對質(zhì)譜鑒定效果的影響均無統(tǒng)計學意義；同樣，培養(yǎng)溫度28 ℃和35 ℃對鑒定效果亦無影響。MALDI-TOF MS技術鑒定絲狀真菌影響因素較多，因此條件探索仍須做進一步研究。

5 MALDI-TOF MS技術鑒定絲狀真菌的展望

MALDI-TOF MS技術操作簡單、成本低廉、鑒定準確、鑒定周期短，在全世界應用越來越廣泛，并將逐漸取代傳統(tǒng)的鑒定方法。由于絲狀真菌存在種類繁多，破壁困難，易污染及影響因素多等諸多問題，故找到優(yōu)化條件，制定統(tǒng)一的操作規(guī)范，提高MALDI-TOF MS技術鑒定絲狀真菌的能力還有待繼續(xù)研究，并且絲狀真菌的數(shù)據(jù)庫還須要不斷完善，鑒定方法和培養(yǎng)時間也須要做進一步的探索和研究。實驗室可以結(jié)合自身特點，建立個性化數(shù)據(jù)庫，從而提高鑒定的陽性率和準確率。隨著研究的不斷深入，經(jīng)驗的逐步積累，相信MALDI-TOF MS技術在臨床實驗室絲狀真菌的快速鑒定中會發(fā)揮越來越重要的作用。

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