類風濕關節炎相關外泌體及其治療作用的研究進展

李培霆，李龍

(貴州醫科大學，貴陽550004)

類風濕關節炎(RA)是一種慢性進展性自身免疫性疾病，以炎性細胞在關節處浸潤、滑膜增生、血管翳形成、關節軟骨及骨持續破壞為特征。RA早期關節疼痛、腫脹、發僵等一系列問題，使患者活動困難，如果得不到及時治療，就會發展到慢性炎癥失控狀態。外泌體是源于細胞內吞作用的細胞外囊泡(EVs)，內含豐富生物信息，其存在于許多甚至是全部真核生物的體液中[1]。外泌體類似于病毒顆粒，可將特定的內含物包裹后運輸至靶細胞，進而調控后者的信號轉導通路以及基因表達，從而引起特定的生理功能。外泌體的蛋白組成較復雜,包括源細胞非特異性和特異性兩類蛋白分子。前者包括熱休克蛋白、參與細胞內信號轉導的蛋白、各種代謝酶、細胞溶質蛋白和四跨膜蛋白等；后者只存在于某種特殊的細胞，如樹突狀細胞(DC)等[2]。外泌體除含有蛋白，還含有小RNA，如微小RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(IncRNA)，參與基因的表達調控，故外泌體內部所含的生物學信息有望作為自身免疫性疾病診斷的理想標志物。研究報道，外泌體參與RA的發病過程，在抗原表達、炎癥、血管生成、細胞信號傳導等方面發揮重要作用[3]。外泌體預示著細胞的病變，遠早于組織和器官病變，對疾病早期診斷有重要意義，且有望作為藥物傳遞的工具或RA治療的靶點。

1 RA相關外泌體

不同自身抗體的檢測對RA診斷具有不同程度的敏感性和特異性，但由于受年齡、血脂、基礎疾病等因素影響,需要更多的生物標記物來更有效、更方便地診斷RA。外泌體作為最小的EVs已被認為是微環境中的通訊途徑。它們在細胞間傳遞蛋白質和miRNAs，并具有免疫調節特性，在不同的關節疾病中已經檢測到相關的外泌體類型，提示外泌體可作為診斷或評估RA活動的潛在生物標志物。

1.1 與RA相關的外泌體蛋白 研究發現，RA患者的滑膜液和血清EVs含有與RA相關的特異蛋白，這些蛋白質一半以上以瓜氨酸形式存在，進一步提高了其作為診斷指標的特異性。在RA患者血清中，外泌體淀粉樣蛋白A和淋巴管內皮透明質酸受體-1蛋白與C反應蛋白之間存在顯著的正相關關系，提示RA患者外泌體淀粉樣蛋白A和淋巴管內皮透明質酸受體-1蛋白與疾病活動有關[4]。外泌體攜帶有瓜氨酸蛋白(如纖維蛋白原和波形蛋白)，作為自身抗原可被RA患者的自身抗體識別后誘導滑液中免疫復合物形成，進而刺激關節中性粒細胞產生白三烯，從而加重炎癥。除了瓜氨酸蛋白，還有一種由巨噬細胞通過外泌體分泌的核DNA結合蛋白，也可作為自身抗原呈遞給B細胞，產生自身抗體，形成免疫復合物參與關節炎癥的發生[5]。最近研究表明，RA患者滑液中CD3+和CD8+T細胞源性EVs、CD41 EVs比骨關節炎患者顯著增高，且骨關節炎中CD41 EVs無法檢測到[6]。

1.2 與RA相關的外泌體酶 除了前面提到的蛋白，研究還發現一些酶類如金屬蛋白酶氨基肽酶N與RA的發病有關。它在RA患者的滑液中作為EVs表面可溶性分子，可通過基質金屬蛋白酶(MMP)-1從纖維樣滑膜細胞表面(FLSS)裂解，誘導FLSS的生長和遷移，進一步加重關節炎癥[7]。D和B-葡糖醛酸酶存在于RA和骨性關節炎患者關節間隙的EVs中，其在EVs中的定位表明它可能參與了RA的發展[8]。EVs還具有不同的黏附分子，促進其與免疫細胞的相互作用，如整合素ανβ3和ανβ5[9]。Rab27蛋白是外泌體分泌過程中必不可少的。研究發現，敲除Rab27基因的Treg細胞失去分泌外泌體的功能后，無法預防部分自身免疫疾病發生，最終導致嚴重的系統性炎癥疾病[10]。

1.3 與RA相關的外泌體核酸 對外泌體miRNA差異的新認識為更早、更準確地檢測RA提供了一種新方法。目前研究最多的miRNA是miR155和miR146a。miR155在FLS中可以抑制腫瘤壞死因子-α、MMP-13的產生[11]。RA患者FLSS中，miR146a表達可被腫瘤壞死因子-α和IL-1β上調，進而抑制IL-6和IL-8分泌，此外miR124a、miR19a等均具有調節滑膜細胞增殖和炎性因子的釋放作用[12]。Kim等[13]研究發現，miR-let7b包含在巨噬細胞或RA成纖維細胞的EVs中，可作為TLR7的內源性配體，兩者結合后可誘導幼稚髓系細胞分化為M1型巨噬細胞，從而釋放促炎癥因子，進一步加重關節炎癥。不僅如此，一些可以調節信號通路的外泌體RNA也被陸續揭示。Maeda等[14]通過基因芯片篩選出22個FLS-miRNA的外泌體被證明可以調節RA中的骨通路，例如，腫瘤壞死因子(TNF)可上調RA FLS分泌的外泌miR-211-3p過表達，抑制成骨細胞的分化、鈣化。除了miRNA，近年發現一種反轉錄IncRNA(Hotair)在RA患者血清外泌體中高表達，可誘導活化的巨噬細胞遷移，導致MMP-2和MMP-13水平明顯降低[15]?？梢娡饷隗w中富含的蛋白質以及核酸不僅參與了RA的發病，而且還是RA具有診斷價值的生物標志物。

2 外泌體在RA治療中的作用

眾所周知，抗RA的藥物包括非甾體類抗炎藥、皮質類固醇和抗風濕疾病藥物，這些療法都沒能從根本上治療RA。然而藥物的不良作用一直是RA治療的障礙，特別是新的生物制劑。在RA中，利用外泌體能再次誘導機體對自身抗原的耐受，可防止疾病的發生發展。

有文獻報道，在RA中檢測到由FLSS釋放的EVS是一種膜型TNF-α的EVS。這些TNF表達陽性的外泌體使活化的T細胞具有抗凋亡的能力，進而引起炎癥反應，這也是T細胞介導RA的發病機制之一。提示阻斷TNF表達外泌體是治療RA的一種方法。DC衍生外泌體是非常穩定而被譽為腫瘤免疫治療的“疫苗”。用帶有FasL基因的重組腺病毒轉染DC能夠抑制膠原誘導的關節炎炎癥反應。此外，IL-10誘導的DC來源的外泌體具有較強的抗T細胞活性。當分離、純化后注射到炎癥部位，炎癥可得到減輕，注射的對側關節炎癥反應也得到了改善。還有研究表明，高表達吲哚胺雙氧酶的DC起源的外泌體能夠在一定程度上緩解膠原誘導小鼠的關節炎癥狀，且免疫抑制作用比DC本身還要強，可能是外泌體可促進Treg細胞的激活與增殖。因此,DC來源的外泌體可能為治療RA的一種新療法。在實驗性關節炎模型中，中性粒細胞衍生的EVs已被證明對RA的軟骨合成有促進作用。體外和體內實驗表明，中性粒細胞可分泌含有抗炎癥蛋白A(AnxA1)的EVs。促進軟骨細胞產生TGF-β1，關節間隙注射含AnxA1的EVs可使炎癥性關節炎小鼠軟骨破壞減少[6]。

最新研究[17]發現，脂質體是一種類似外泌體的小人工囊泡，它具有裝載藥物進入細胞的能力。利用這一特性，將APO2L與脂質體結合后注射入動物的膝關節腔內可大幅減少滑膜增生和炎癥。Vanniasinghe等[18]成功地將糖皮質激素以人工囊泡的形式傳遞到滑膜，在膠原誘導關節炎模型中觀察到炎癥減輕。通過脂質體的輸送，可很大程度上減少類固醇類藥物不良作用。Lamichhane等[19]發現，骨髓間充質干細胞釋放的EVs是近年發現的簡化無細胞的組織再生療法，藥物等活性分子可以被填充于骨髓間充質干細胞且衍生EVs,比單用骨髓間充質干細胞療效增強，為治療自身免疫性疾病的一種潛在替代方法。

免疫復合物在組織中的沉積被認為是RA發病主要機制之一。補體參與免疫復合物組成，且分布于滑液中EVs表面。事實上，一旦補體級聯被激活，許多促炎產物就會釋放出來，在膠原誘導關節炎模型中，注射抗C5單克隆抗體可抑制關節炎的發生，提示可能是補體與EVs相互作用導致RA炎癥狀態。有文獻[20]報道，腫瘤移植到缺乏DNA結合核轉錄因子抑制物1表達的小鼠體內未能生長和轉移，表明DNA結合核轉錄因子抑制物1參與了血管生成。Edhayan等[21]研究發現，在RA患者的滑膜成纖維細胞中，DNA結合核轉錄因子抑制物1包被在EVs中，且是成纖維細胞分泌的主要成分，激活內皮細胞c-Jun氨基末端激酶信號，在體外和體內產生促血管形成作用。因此，外泌體DNA結合核轉錄因子抑制物1可能是一種有用的治療方法。除了DC和中性粒細胞衍生的外泌體具有治療作用外，還有口服牛乳源性EVs可減輕膠原誘導型關節炎模型炎癥的報道。由此預測，外泌體自身不僅可作為治療藥物，而且可作為結合藥物的載體，滿足精準治療的需求。

綜上所述，外泌體在RA的治療中顯示出了巨大的優勢和潛力。外泌體相比其他在生物體液如血清或尿液中發現的生物標志物，表現出較高的特異性和穩定性。這使得外泌體中的蛋白質及IncRNA成為研究熱點。目前外泌體的分離手段很難獲得十分純凈而且單一的外泌體樣品，并且沒有任何一個單一實驗可以確定外泌體的存在。故未來的研究將需要開發標準化的EV分離和量化技術。RA血液衍生外泌體對破骨細胞的分化有明顯抑制作用，是人類破骨發生的新調節因子，那外泌體是如何選擇性表達某種信號分子仍需要大量的研究來解釋。當然，外泌體還參與免疫抑制細胞的免疫抑制和活化，調節抗原的表達，誘導T細胞凋亡。深入了解兩者之間的聯系有利于為將來診斷和治療RA提供創新性線索。