山奈酚抑制小鼠黑色素瘤細胞增殖的縫隙連接機制觀察

周瑤，唐毅，杜標炎

(1湖南中醫藥高等專科學校，湖南株洲412012；2湖南中醫藥高等專科學校附屬第一醫院；3廣州中醫藥大學)

黑色素瘤對放療、化療不敏感，且容易轉移復發，患者預后差[1,2]。山奈酚屬于黃酮類化合物，具有抗腫瘤作用，且毒副作用小，能提高正常皮膚的抗氧化能力，抑制皮膚損傷和腫瘤發生[3～5]。縫隙連接又稱信息連接，是相鄰細胞側面的一種跨膜通道，主要介導細胞間的物質和信息交換，對細胞新陳代謝、內環境穩定、增殖和分化等生理過程均具有重要的調節作用。研究表明，多種抗腫瘤藥物的活性成分可通過加強腫瘤細胞的縫隙連接通訊功能達到抗腫瘤的效應。縫隙連接的基本單位為縫隙連接蛋白(Cx)，其在腫瘤細胞的形成和發展方面具有重要的調節作用[6,7]，其中以縫隙連接蛋白43(Cx43)在人體內分布最廣、數量最多、與腫瘤聯系最為密切[8,9]。2016年1月～2017年3月我們從調節細胞間Cx43表達量和縫隙連接通訊的角度入手，觀察了山奈酚抑制小鼠黑色素瘤B16細胞增殖的作用。現報告如下。

1　材料與方法

1.1材料山奈酚購自美國Sigma公司(批號：60010，純度>97%)。小鼠黑色素瘤細胞B16購于中國科學院細胞庫。細胞培養用RPMI 1640粉、胰蛋白酶和新生牛血清、Cx43一抗均購自Gibco公司，青、鏈霉素雙抗合劑購自Hyclone公司，MTT購自美國Sigma公司，二甲基亞砜(DMSO)購自上海滬試實驗室器材股份有限公司。倒置顯微鏡(重慶COIC)，Bio-Rad-680型全自動酶標儀(日本Bio-Rad)。

1.2細胞培養將B16細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養；第2天，棄掉原培養基，替換為含10% FBS+90% RPMI 1640+1%雙抗的完全培養基，繼續培養；當細胞融合率達80%～90%時，1∶2胰酶消化傳代。

1.3山奈酚抑制B16細胞存活率的最佳濃度篩選將B16細胞接種于96孔板(2×104個/mL，每孔100 μL)培養24 h，分別加入終濃度為3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L山奈酚，每組設6個復孔(100 μL/孔)。培養箱中繼續培養72 h，采用MTT法檢測細胞存活率。酶標儀測定490 nm波長處每孔吸光度(A)值。計算山奈酚對B16細胞的半數致死量。結果顯示，3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L山奈酚處理細胞72 h，細胞增殖抑制率分別為5.325%、12.148%、16.974%、34.345%、61.764%、77.716%，即不同劑量的山奈酚對B16細胞均有生長抑制作用，其作用呈濃度依賴性。山奈酚對B16的半數致死濃度為34.38 μmol/L，因此后續實驗中山奈酚的藥物濃度選擇為12.5、25、50 μmol/L。

1.4山奈酚對B16細胞數量及形態影響的觀察將細胞消化后接種于24孔板培養24 h，隨機分為四組，分別加入0(陰性對照)、12.5、25、50 μmol/L山奈酚，作用72 h，光鏡下觀察各組細胞的數量及形態變化。

1.5山奈酚對B16細胞縫隙連接通訊功能影響的觀察將細胞預先分為供體細胞組和接受細胞組，兩組分別設山奈酚0、12.5、25、50 μmol/L四個濃度，均藥物干預72 h；將各濃度組供體細胞用PBS洗1次，避光下將細胞與Calcein-Am 0.2 μL和CMTMR-Am 0.4 μL用無血清RPMI 1640培養基共同孵育，1 h后消化計數，稀釋至5 000個/mL；另將各濃度接受細胞用PBS洗1次，按原濃度對應組分別重新添加對應濃度藥液，仍為0、12.5、25、50 μmol/L四個濃度；將稀釋好的供體細胞添加至對應濃度的接受細胞組，每孔添加1 mL供體細胞懸浮液，孵育4 h；采用熒光示蹤法于熒光顯微鏡下計算每個供體細胞周圍含有Calcein-Am的接受細胞數目。

1.6山奈酚對B16細胞Cx43蛋白表達影響的觀察將細胞消化后接種于24孔板培養24 h，隨機分為四組，分別給予0、12.5、25、50 μmol/L山奈酚干預72 h，收集各組細胞，采用Western blotting法檢測Cx43蛋白相對表達量。

2　結果

2.1各組細胞生長形態比較光鏡下可見陰性對照細胞密度高，形態多為菱形，細胞輪廓清晰，細胞核染色均勻。山奈酚組隨著山奈酚濃度的升高，鏡下細胞數量越來越少，細胞形態逐漸不規則，出現很多分支突起；上述變化以50 μmol/L組表現最為明顯，且細胞核中出現明顯顆粒狀物質。

2.2各組細胞縫隙連接通訊功能比較山奈酚作用于B16細胞72 h時，在熒光顯微鏡下可見供體細胞貼壁不久即呈圓形，隨著山奈酚濃度的增加，每個黃色供體細胞旁的綠色接受細胞數目明顯增多。0、12.5、25、50 μmol/L山奈酚組每個供體細胞周圍接受細胞的個數分別為(1.95±1.35)、(7.10±2.12)、(13.48±5.36)、(35.13±6.09)個，各濃度間比較P均<0.01。

2.3各組Cx43蛋白表達比較0、12.5、25、50 μmol/L山奈酚組Cx43蛋白相對表達量分別為0.17、0.28、0.48、0.83，各濃度間比較P均<0.01。

3　討論

山奈酚是一種研究較多的具有抗癌效應的黃酮類化合物，主要來源于姜科植物山奈的根莖，在其他植物如蔬菜、水果、中藥材中也廣泛存在。已有大量研究報道，山奈酚對肝癌、胃癌、腸癌、肺癌、乳腺癌、膽管癌、大鼠前列腺細胞癌、白血病等具有抗癌效應，且安全無毒，具有良好的臨床應用前景[4，9，11～16]。

縫隙連接是細胞間一種重要的細胞連接，能聯通相鄰兩側細胞，是細胞間重要的交通管道，供細胞間交換小分子物質和離子等，以傳遞細胞間的化學信息，故又被稱為通信連接[17]。研究表明，縫隙連接通訊功能低下是腫瘤細胞生長和轉移的重要原因，通過增強癌細胞間的縫隙連接通訊功能，加速細胞間化學物質和化學信息的傳遞，是某些抗癌藥物起效的重要作用機制[18]。Cx是縫隙連接的物質組成基礎，其表達可影響細胞間的縫隙連接通訊功能。研究顯示，通過對Cx低表達的腫瘤組織重新引入Cx使其恢復原有表達或過表達，均可抑制腫瘤的體外增殖和腫瘤的體內生長[7]，說明Cx與腫瘤關系密切，對腫瘤具有抑制作用。Cx43普遍存在于所有細胞中，是現今研究的熱點，很多惡性腫瘤包括黑色素瘤均存在Cx43或縫隙連接通訊下調[19]。已有研究證實，抗癌藥物能通過改善腫瘤細胞膜上Cx43的表達量來促進細胞間縫隙連接通訊功能，從而增強藥物的腫瘤殺傷效應，并在腫瘤的自殺基因療法中使自殺基因系統的毒性產物更多地通過縫隙連接通道傳導到未轉染自殺基因的細胞中，進而增強藥物的旁殺傷效應[3]。

本研究結果顯示：山奈酚能體外抑制B16細胞增殖，光鏡下見山奈酚作用下細胞數量減少、形態變得不規則，且上述作用隨著藥物作用濃度的升高而增強。細胞接種熒光示蹤法顯示，經山奈酚處理后的藥物組供體細胞旁的接受細胞數目顯著增加，且具有量效依賴性，說明藥物組細胞間的物質傳遞功能增強，山奈酚能通過促進B16細胞間縫隙連接通訊功能實現對腫瘤細胞的殺傷效應。Western blotting檢測結果顯示，山奈酚上調B16細胞Cx43蛋白表達量，且有明顯的量效關系，初步揭示了山奈酚促進B16細胞縫隙連接通訊功能的具體機制。

綜上所述，山奈酚可抑制小鼠黑素瘤B16細胞增殖，具有明確的抗腫瘤作用；促進Cx43表達和縫隙連接通訊功能可能是其作用機制。

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