C反應(yīng)蛋白對(duì)大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制

裴瑋娜，呼海娟，劉凡，魯靜朝，楊秀春，崔煒

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院·河北省心腦血管病研究所，石家莊050000)

C反應(yīng)蛋白(CRP)是一種由肝臟合成的急性時(shí)相蛋白，是預(yù)測(cè)未來(lái)心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1, 2]，而且病理水平的CRP可能直接參與了動(dòng)脈粥樣硬化的形成、演變以及缺血再灌注損傷的過(guò)程[3]。然而，CRP是否能夠直接加重心肌缺血再灌注損傷這一過(guò)程及其發(fā)生機(jī)制目前尚不十分明確。2015年3月～2016年3月，我們采用乳鼠原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞建立氧糖剝奪再灌注模型，探討CRP作為刺激因子對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人重組CRP 購(gòu)自于Calbiochem公司，Ⅱ型膠原酶購(gòu)自于美國(guó)Gibco公司，二氮嗪(DZ)和環(huán)孢素A (CsA)均購(gòu)自于Sigma公司，乳酸脫氫酶(LDH)漏出檢測(cè)試劑盒由中國(guó)南京市建城生物工程研究所提供。鱟試劑內(nèi)毒素去除試劑盒購(gòu)自廈門(mén)鱟試劑生物科技股份有限公司。CRP制劑去除內(nèi)毒素，經(jīng)純化后由鱟試劑測(cè)定CRP中內(nèi)毒素濃度<0.1 EU/mL。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取出生1～2 d的新生SD大鼠心室心肌細(xì)胞,應(yīng)用胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶消化，然后用包含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。心肌細(xì)胞以1×105/mL的密度接種于96孔板上，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，其中培養(yǎng)48 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液。在培養(yǎng)基中加入5-溴-2'-脫氧尿苷以抑制成纖維細(xì)胞的附著和增殖。利用抗α-肌動(dòng)蛋白免疫組化法鑒定心肌細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞中95%以上為心肌細(xì)胞。

1.3 氧糖剝奪再灌注模型 (OGD/R)建立 原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同處理方案后進(jìn)行氧糖剝奪3 h，再灌注1 h。將加入了無(wú)糖DMEM培養(yǎng)液心肌細(xì)胞置于三氣培養(yǎng)箱內(nèi)(5%CO2和95% N2，37℃)培養(yǎng)3 h。再灌注時(shí)，則將無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基更換為高糖DMEM培養(yǎng)基，并置于5%CO2培養(yǎng)箱中(21%O2和5%CO2)37℃孵育1 h，以此來(lái)模擬體內(nèi)的缺血再灌注過(guò)程。

1.4 細(xì)胞分組 原代培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為以下5組。①對(duì)照組：沒(méi)有經(jīng)過(guò)OGD/R的正常培養(yǎng)組。②OGD/R組：培養(yǎng)后建立OGD/R；③CRP+OGD/R組：進(jìn)行OGD/R之前，應(yīng)用10 μg/mL的CRP與心肌細(xì)胞共同孵育24 h；④CRP+CsA+OGD/R組：心肌細(xì)胞先與CRP共同孵育24 h，然后進(jìn)行3 h的氧糖剝奪。在再灌注開(kāi)始時(shí)加入10 μmol的CsA與心肌細(xì)胞孵育20 min；⑤CRP+DZ+OGD/R組：心肌細(xì)胞先與CRP共同孵育24 h，在進(jìn)行OGD/R前，加入100 μmol的二氮嗪共同孵育90 min，再進(jìn)行OGD/R。

1.5 心肌細(xì)胞活力測(cè)定 采用MTS法測(cè)定心肌細(xì)胞活力。各組樣品37 ℃避光培養(yǎng)1 h，使用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)各孔吸光度(OD)值，以O(shè)D值間接反映心肌細(xì)胞活力。

1.6 心肌細(xì)胞培養(yǎng)液LDH水平檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留取各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，以1 000 r/min 離心1 min后取上清液，標(biāo)本置于-80 ℃低溫冰箱保存、備用。通過(guò)檢測(cè)從質(zhì)膜破裂細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH水平，判斷細(xì)胞壞死程度。

1.7 線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開(kāi)放水平測(cè)定 采用calcein/AM免疫熒光法。選擇復(fù)氧后20 min測(cè)定心肌細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度，設(shè)定激發(fā)光為488 nm，檢測(cè)光為505nm，通過(guò)Image J軟件分析綠色熒光強(qiáng)度，以此確定mPTP開(kāi)放水平。綠色熒光強(qiáng)度的變化與mPTP開(kāi)放程度呈反比。

1.8 線粒體膜電位水平測(cè)定 采用四甲基羅丹明乙酯(TMRE)免疫熒光法。設(shè)定激發(fā)光為543 nm，檢測(cè)光為580 nm，通過(guò)Image J軟件分析紅色熒光強(qiáng)度，以此確定線粒體膜電位水平。紅色熒光強(qiáng)度與線粒體膜電位水平呈正比。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞活力比較 以對(duì)照組心肌細(xì)胞活力為100%，其他各組心肌細(xì)胞活力以占對(duì)照組數(shù)值的百分比表示。OGD/R組、CRP+OGD/R組、CRP+CsA+OGD/R組、CRP+DZ+OGD/R組心肌細(xì)胞活力分別為82.36%±6.18%、64.84%±4.06%、91.30%±5.18%、92.63%±5.74%。經(jīng)過(guò)OGD/R處理后，心肌細(xì)胞活力下降；CRP預(yù)處理組可進(jìn)一步降低心肌細(xì)胞活力；給予CsA或DZ預(yù)處理后心肌細(xì)胞活力增高；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05) 。

2.2 各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液LDH水平比較 對(duì)照組、OGD/R組、CRP+OGD/R組、CRP+CsA+OGD/R組、CRP+DZ+OGD/R組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液LDH水平分別為(95.10±21.57)、(145.30±16.06)、(208.20±19.23)、(92.72±17.56)、(93.37±23.99)U/L。與對(duì)照組比較，OGD/R組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液LDH水平上升；給予CRP預(yù)處理后，LDH水平進(jìn)一步升高；預(yù)先給予CsA或DZ處理均能夠降低LDH水平；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.3 各組mPTP開(kāi)放水平比較 以對(duì)照組mPTP綠色熒光強(qiáng)度為100%，各組與對(duì)照組比較進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。OGD/R組、CRP+OGD/R組、CRP+CsA+OGD/R組、CRP+DZ+OGD/R組mPTP綠色熒光強(qiáng)度分別為60.93%±2.82%、33.08%±3.48%、85.09%±4.11%、81.17%±4.13%。與對(duì)照組相比，OGD/R組心肌細(xì)胞mPTP開(kāi)放水平升高；給予CRP干預(yù)mPTP開(kāi)放水平進(jìn)一步升高；預(yù)先給予CsA或DZ處理mPTP開(kāi)放水平降低；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.4 各組線粒體膜電位水平比較 以對(duì)照組粒體膜電位紅色熒光強(qiáng)度為100%，各組與對(duì)照組比較進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。OGD/R組、CRP+OGD/R組、CRP+CsA+OGD/R組、CRP+DZ+OGD/R組線粒體膜電位紅色熒光強(qiáng)度分別為57.26%±2.95%、33.31%±2.03%、77.35%±2.38%、72.26%±2.45%。與對(duì)照組比較，OGD/R組線粒體膜電位水平降低；給予CRP干預(yù)膜電位水平進(jìn)一步下降；預(yù)先給予CsA或DZ處理膜電位水平升高；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

3 討論

目前，再灌注治療已經(jīng)成為缺血性心臟病的重要治療手段。然而再灌注的同時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷及心臟功能障礙，即形成心肌缺血再灌注損傷(MIRI)[4]。建立心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷模型，對(duì)于在細(xì)胞層面研究這一病生理過(guò)程意義重大。為此，本研究通過(guò)原代培養(yǎng)SD大鼠心肌細(xì)胞并建立OGD/R模型來(lái)模擬體內(nèi)的心肌缺血再灌注損傷的病理過(guò)程。

CRP不僅僅是急性期時(shí)相的一種炎癥標(biāo)記物，而且與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，CRP可以預(yù)測(cè)冠心病患者日后發(fā)生心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)[5～8]。Paul等[9]研究證實(shí)，人類(lèi)CRP轉(zhuǎn)基因表達(dá)加速了缺乏載脂蛋白E的小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。Verma等[10]研究表明，CRP可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的活化、加重功能障礙，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡蛋白酶介導(dǎo)的人類(lèi)冠狀動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，從而加重了心肌梗死和動(dòng)脈粥樣硬化血栓的形成。此外，他們還發(fā)現(xiàn)這些影響與CRP中的疊氮化鈉或內(nèi)毒素?zé)o關(guān)。研究認(rèn)為，CRP的作用機(jī)制包括補(bǔ)體的激活、血管壁損傷、血栓形成狀態(tài)、內(nèi)皮功能障礙以及氧化低密度脂蛋白的調(diào)節(jié)作用等[11]。另有報(bào)道顯示，CRP檢測(cè)對(duì)原發(fā)性心血管疾病預(yù)防及心力衰竭、房顫和冠狀動(dòng)脈支架血栓形成或再狹窄的預(yù)后判斷有重要作用。此外，已有一些研究探討了CRP對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響[12]。

Thiele等[13]認(rèn)為CRP五聚體的分離，即由五聚體結(jié)構(gòu)分離成單體結(jié)構(gòu)這一過(guò)程可以調(diào)節(jié)急性炎癥反應(yīng)(心臟缺血/再灌注)和慢性炎癥過(guò)程(動(dòng)脈粥樣硬化)。一些關(guān)于腸道、腎臟、肝臟等器官的缺血再灌注動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究顯示加入CRP干預(yù)后可以增加組織損傷[14,15]。本研究顯示，在OGD/R前給予CRP干預(yù)24 h能夠明顯降低心肌細(xì)胞活力，并升高LDH濃度水平。提示CRP直接加重了OGD/R損傷，此為臨床減少再灌注損傷提供了新的治療靶點(diǎn)。

心肌缺血再灌注損傷與線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)的抑制和mPTP通道的開(kāi)放息息相關(guān)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，作為一種位于線粒體內(nèi)膜中的非選擇性高電導(dǎo)通道，mPTP的開(kāi)放介導(dǎo)了缺血再灌注損傷早期的細(xì)胞凋亡。在缺血發(fā)生時(shí)，mPTP處于關(guān)閉狀態(tài)。再灌注開(kāi)始后，線粒體Ca2+濃度明顯增高，并且活性氧簇(ROS)生成增加，引起mPTP開(kāi)放，繼而產(chǎn)生一系列的病理過(guò)程，導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，mitoKATP在缺血預(yù)處理心肌保護(hù)中有重要作用。在缺血過(guò)程中，mitoKATP通道的開(kāi)放會(huì)導(dǎo)致線粒體膜的去極化，線粒體膜電位的降低，從而導(dǎo)致蛋白激酶C活化，抑制ROS的生成，進(jìn)而抑制細(xì)胞的凋亡。DZ是一種選擇性的mitoKATP通道開(kāi)放劑，它通過(guò)保護(hù)線粒體完整性和抑制細(xì)胞凋亡來(lái)減少線粒體損傷。CsA是一種mPTP的抑制劑，已經(jīng)被證實(shí)其可以減少心肌梗死面積，維持心臟功能。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，OGD/R組心肌細(xì)胞mPTP開(kāi)放升高、線粒體膜電位水平降低；給予CRP干預(yù)mPTP開(kāi)放水平進(jìn)一步升高、膜電位水平進(jìn)一步下降；預(yù)先給予CsA或DZ處理mPTP開(kāi)放降低、膜電位水平升高。同時(shí)，各組心肌細(xì)胞活力和LDH水平隨mPTP開(kāi)放水平、線粒體膜電位水平改變發(fā)生相應(yīng)變化，此可能就是CRP加重心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制。

綜上所述，CRP能夠直接加重心肌缺血再灌注損傷。CRP促進(jìn)mPTP開(kāi)放并降低線粒體膜電位可能是其加重心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制之一。