抵抗素樣分子影響大鼠主動脈壁血管平滑肌細胞收縮作用的機制

段淑香,張洪強,楊永曜,張紅明,徐慶國

(1山東省立第三醫院，濟南250000；2濟南軍區總醫院；3貴州省人民醫院)

冠狀動脈痙攣(CAS)是指心外膜下傳導動脈發生一過性收縮，引起血管部分或完全閉塞，導致心肌缺血的一組臨床綜合征。CAS是構成多種心臟缺血性疾病的基本病因，包括變異型心絞痛、不穩定型心絞痛、猝死等[1]。目前CAS的確切發生機制不明確，推測可能與血管內皮功能障礙、氧化應激、血管平滑肌細胞高反應性以及血管收縮和舒張物質的失衡有關[2]。抵抗素樣分子(RELMɑ)是脂肪組織分泌具有生物活性的蛋白質，有促進血收縮管、血管新生的作用。前期研究中，我們已證實RELMɑ在動脈粥樣硬化斑塊中強烈表達[3]，同時發現其也是血管生成的開關基因[4]。2016年8月～2017年3月，我們就RELMα信號轉導通路對動脈粥樣硬化中血管收縮動態平衡的影響進行了研究，以尋找CAS防治的新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠由山東大學實驗動物中心提供；大鼠主動脈平滑肌細胞(RASMC)購自Scien Cell公司；DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；重組RELMα蛋白購自美國Prospec公司；兔源單克隆抗大鼠鈣調素(CaM)、肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)抗體購自美國Abcam公司；CaM抑制劑W-7、MLCK抑制劑ML-7均購自美國Sigma公司；HRP標記的羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司。

1.2 大鼠血管環張力測定 取SD大鼠10只用10%水合氯醛麻醉，處死后打開胸腔，游離胸主動脈，置于4 ℃含95%O2和5%CO2混合氣體預飽和的K-H液中，小心剔除胸主動脈周圍結締組織，剪成3～4 mm的血管環(去內皮血管環)。選取反應良好的血管環，利用Powerlab四道生理儀記錄其張力變化。血管環穩定后，用移液器吸取RELMα、AngⅡ、MLCK抑制劑或者等量的平衡液分別向浴槽中加入，稀釋后的浴槽濃度即為實驗的終濃度，觀察其對血管的效應。

1.3 RASMC培養 RASMC置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，使用的培養基為含10%胎牛血清、100 g/L青霉素和100g/L鏈霉素的DMEM高糖培養基，待細胞長至70%～80%融合時進行藥物干預。采用3～5代細胞進行以下實驗。

1.4 RASMC分組及干預 RASMC在6孔板中培養24 h后隨機分為5組。正常對照組RASMC在37 ℃培養箱中培養48 h；陽性對照組用終濃度為1×10-7mol/L的AngⅡ刺激細胞48 h；RELMα刺激組：終濃度為4×10-8mol/L的RELMα刺激細胞48 h；RELMα+CaM抑制劑組：RELMα+W-7刺激細胞48 h；RELMα+ MLCK抑制劑組：RELMα+ML-7刺激細胞48h。

1.5 RASMC內CaM和MLCK蛋白表達檢測 采用Western blotting法。提取各組RASMC總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠分離蛋白后，轉移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，加入一抗4 ℃孵育過夜：抗CaM一抗(稀釋度1∶1 000)，抗MLCK一抗(稀釋度1∶3 000)，抗β-actin(濃度1∶1 000)。次日將膜取出，TBST洗脫3次，孵育二抗(濃度為1∶10 000)置于室溫1.5 h。根據ECL試劑盒說明書操作發光自顯影，拍照并用隨機軟件分析條帶光密度。β-actin作為內參照物，通過計算CaM/β-actin、MLCK/β-actin的光密度比值求得各組CaM、MLCK蛋白表達。

2 結果

2.1 不同處理方式大鼠胸主動脈血管環張力變化 血管環在加入RELMα后2 min左右血管張力開始升高，10 min左右達到平臺期；加入MLCK抑制劑，再加入RELMα后血管環張力無明顯升高。加入等量平衡液、AngⅡ、RELMα、RELMα+MLCK處理血管環后，血管張力分別為7.27%±2.23%、59.97%±5.56%、85.07%±3.06%、11.02%±2.41%。與加入等量平衡液、AngⅡ比較，加入RELMα后血管張力升高；再加入ML-7后血管張力下降，且低于AngⅡ，差異均有統計學意義(P均<0.05)。

2.2 各組RASMC內CaM蛋白表達 正常對照組、陽性對照組、RELMα刺激組、RELMα+CaM抑制劑組CaM蛋白表達分別為0.24±0.08、0.62±0.20、1.41±0.33、0.45±0.33。RELMα刺激后能明顯增加CaM蛋白表達，RELMα刺激組CaM蛋白高于正常對照組和陽性對照組(P均<0.05)；加用CaM抑制劑W-7后，RASMC內CaM蛋白表達降低(P<0.05)，但其表達量仍高于正常對照組(P<0.05)。

2.3 各組RASMC內MLCK蛋白表達 正常對照組、陽性對照組、RELMα刺激組、RELMα+MLCK抑制劑組蛋白表達分別為0.23±0.15、0.60±0.27、1.29±0.30、0.24±0.15。RELMα可刺激RASMC內MLCK蛋白的表達增加，RELMα刺激組MLCK蛋白表達高于正常對照組和陽性對照組(P均<0.05)；加用MLCK抑制劑ML-7， RASMC內MLCK蛋白表達降低(P<0.05)，RELMα+MLCK抑制劑組與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

RELMα作為一種脂肪細胞因子，在正常組織中表達較少，在肺動脈高壓及動脈粥樣硬化模型中表達升高。RELMα除具有強大的收縮血管的作用外，還有促進血管新生、增殖的作用。目前， RELMɑ在呼吸系統疾病中的研究較多，主要為該因子在肺動脈高壓、肺纖維化、支氣管哮喘、肺發育和代償性增生等過程中的作用[5～7]。RELMɑ在心血管疾病方面的研究多為體外實驗，RELMɑ與動脈粥樣硬化進展中血管收縮與冠脈血管穩定性關系的報道甚少。本課題組在ApoE基因敲除的鼠動脈粥樣硬化斑塊內進行RELMɑ的RT-PCR檢測和免疫組化染色發現，對比野生C57/BL小鼠，在動脈粥樣硬化模型粥樣斑塊內明顯可見RELMɑ陽性顆粒及其mRNA表達，從而證實RELMɑ在鼠動脈粥樣硬化斑塊內存在[3]。Teng等[8]研究表明，在缺氧的條件下肺動脈壁內RELMα表達明顯上調；而在動脈粥樣硬化的動脈壁內也存在缺氧，RELMα表達亦明顯上調，因此研究RELMα對RASMC的收縮功能，對預防CAS患者血管痙攣、斑塊破裂具有重要的臨床意義。

本研究采用離體灌流血管環的方法觀察了RELMα收縮血管的作用并與AngⅡ作對比，發現RELMα可引起血管收縮，其作用強于ANGⅡ，加用MLCK抑制劑后，RELMα收縮血管的作用減弱。肌球蛋白輕鏈(MLC)磷酸化是血管平滑肌收縮的最重要步驟之一，MLCK使MLC磷酸化，肌球蛋白磷酸化酶也使MLC磷酸化，兩種機制共同調節MLC的磷酸化水平[9]。血管收縮因子與VSMC表面相應受體結合，激活磷脂酶C(PLC)，通過不同途徑激活MLCK亞單位，磷酸化MLC，使VSMC產生收縮和高反應性。研究證實，RELMα刺激人類肺動脈血管平滑肌細胞后，可引起細胞內鈣離子濃度升高，并進一步證實此過程是通過PLC-IP3途徑實現的[10]。Chen等[11]研究提示，FIZZ1可通過上調MLCK、MLC-20的表達水平增強其對氣道平滑肌的收縮反應；FIZZ1處理氣道后可引起氣管上皮的損傷，并激活c-Raf-ERK1/2-p38MAPK信號轉導通路收縮氣道平滑肌。

為進一步探討RELMα引起大鼠主動脈血管平滑肌細胞收縮的機制，本文對血管收縮信號轉導通路相關蛋白的變化進行了研究。顯示RELMα刺激后大鼠主動脈平滑肌細胞內CaM、MLCK蛋白表達增加，較正常對照組和ANGⅡ刺激組均升高；加入MLCK抑制劑后，RELMα刺激引起大鼠主動脈平滑肌細胞內MLCK蛋白表達不在增高；而加入CaM抑制劑后，RELMα刺激不會引起大鼠主動脈平滑肌細胞內CaM蛋白表達降低的明顯升高，但仍高于正常對照組。提示RELMα對大鼠主動脈平滑肌細胞的收縮作用可通過Ca2+-CaM-MLCK途徑實現，但不是唯一途徑。

綜上所述， RELMα可通過Ca2+-CaM-MLCK途徑引起血管平滑肌收縮，此作用可能在CAS患者血管痙攣的發生和發展過程中發揮了重要作用。