低氧預(yù)處理脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植對小鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡及血管新生的影響

莫壁伶，黃子祥，黃帥，周治來

(1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院荔灣醫(yī)院，廣州510175；2南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院；3廣東省第二人民醫(yī)院)

由于脂肪組織在人體存在廣泛、取材方便，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具備廣泛的免疫調(diào)控功能，因此脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)移植已廣泛應(yīng)用于心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及自身免疫系統(tǒng)疾病治療中[1，2]，成為修復(fù)心肌梗死的一種新策略。但是，心肌梗死后損傷局部缺氧、炎癥等因素不利于細(xì)胞存活，細(xì)胞替代及細(xì)胞分化作用難以充分發(fā)揮作用[3]。低氧可以促進ADSCs對缺氧、炎癥等惡劣微環(huán)境的適應(yīng)能力[4]，為此，本研究通過移植低氧預(yù)處理ADSCs治療心肌梗死小鼠，觀察小鼠心肌梗死周邊細(xì)胞凋亡、血管再生情況，探討低氧預(yù)處理ADSCs移植治療小鼠心肌梗死的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性C57B/L小鼠(南方醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實驗中心)，DMED/F12完全培養(yǎng)液及0.25%胰酶(美國Gibco公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo 公司)，培養(yǎng)瓶(美國Corning 公司)，Olympus倒置光學(xué)顯微鏡(CK2，日本)，倒置熒光顯微鏡(Leica，DMIRE2 ,德國)，Ⅰ型膠原酶(美國Sigma公司)，實時熒光定量儀(ABI7500，美國)。

1.2 ADSCs分離培養(yǎng)及低氧預(yù)處理 取2只C57B/L小鼠腹股溝處皮下脂肪組織，PBS沖洗，Ⅰ型膠原酶消化呈乳糜狀，加等量含10% FBS的DMEM/F12中和膠原酶消化；離心，棄去上清，收集細(xì)胞培養(yǎng)72 h 后換液，去除懸浮細(xì)胞，細(xì)胞逐漸長出，即為原代ADSCs。待原代細(xì)胞融合至80%時進行細(xì)胞傳代，消化離心后用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕柔吹打形成單細(xì)胞懸液，按1∶3進行傳代，并接種于新的25 cm2培養(yǎng)瓶中。取傳至第3代的ADSCs，調(diào)整密度為1×105/mL，將細(xì)胞隨機分為低氧組和常氧組，37 ℃條件下分別置于氧濃度為2%、21%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。

1.3 ADSCs標(biāo)志蛋白及Ki67表達陽性率檢測 取對數(shù)生長期的低氧和常氧培養(yǎng)兩組細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液，以含4%多聚甲醛的PBS室溫固定30 min，隨后0.3% Triton室溫破膜5 min，山羊血清封閉液37 ℃封閉1h。分別加入一抗兔抗Ki67(1∶100, Millipore)、小鼠抗Vimentin(1∶100, Sigma)、兔抗laminin (1∶100, Sigma)。濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，吸除一抗，PBS沖洗后滴加二抗Alexa Fluor 594標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶200)和Alexa Fluor 488標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶200)，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，封片。熒光顯微鏡下隨機選取5～20個高倍視野，計數(shù)相同視野下Ki67、層粘連蛋白、波形蛋白陽性染色的細(xì)胞數(shù)量，計算Ki67陽性表達率。

1.4 ADSCs心臟營養(yǎng)因子mRNA表達檢測 ADSCs心臟營養(yǎng)因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、胎盤生長因子(PLGF)mRNA表達采用實時熒光定量PCR法。取對數(shù)生長期的低氧和常氧培養(yǎng)兩組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗滌單層細(xì)胞。采用TRIZOL試劑提取總RNA，檢測總RNA 濃度和純度合格后，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。PCR 反應(yīng)過程參照前期研究。PCR反應(yīng)體系Q-PCR Mix 10 μL，dd H2O 4 μL，PCR上下游引物各2 μL，cDNA(1∶5) 2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min、95 ℃變性45 s、56 ℃退火45 s、72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.5 小鼠心肌梗死模型構(gòu)建及分組 選取8～10周齡20～25 g的雄性C57B/L小鼠32只，隨機分成假手術(shù)組、模型組、常氧ADSCs移植組、低氧ADSCs移植組，每組8只。麻醉后開胸暴露心臟，在肺動脈圓錐與左心耳交界處下方2～3 mm處穿線，結(jié)扎冠狀動脈前降支(假手術(shù)組僅在相應(yīng)部位穿線但不結(jié)扎)，根據(jù)心電圖ST段抬高和心肌顏色變化確定心肌梗死形成。在心肌顏色變白邊緣選擇3個點，模型組每個點注射10 μL PBS，常氧ADSCs移植組、低氧ADSCs移植組每個點注射分別注射10 μL常氧及低氧培養(yǎng)ADSCs，細(xì)胞濃度為1×105/μL。

1.6 心肌vwF、caspase-3 陽性細(xì)胞檢測 細(xì)胞移植后第4周處死動物，獲取心臟，PBS沖洗后放入含4%多聚甲醛的PBS中固定。石蠟包埋切片，行免疫熒光染色，分別加入一抗兔抗vwF(1∶200, abcam)、兔抗caspase-3(1∶200, Sigma)，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。吸除一抗，PBS沖洗后滴加二抗Alexa Fluor 594標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶200)，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，甘油封片。熒光顯微鏡下隨機選取5～10個高倍視野，計數(shù)相同視野下心肌vwF、caspase-3陽性染色細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 低氧預(yù)處理對ADSCs表面標(biāo)志物表達的影響 低氧組、常氧組細(xì)胞均表達層粘連蛋白和波形蛋白，證明均符合ADSCs特性。低氧組、常氧組ADSCs Ki67表達陽性率分別為78.65%±8.55%、60.56%±5.28%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。顯示低氧組ADSCs增殖活性強于常氧組。

2.2 低氧預(yù)處理對ADSCs心臟營養(yǎng)因子mRNA表達的影響 將常氧組PLGF、HGF及VEGF mRNA表達量設(shè)定為1，低氧組PLGF、HGF及VEGF mRNA相對表達量分別為3.42±0.84、2.45±0.45、1.84±0.73。低氧預(yù)處理組細(xì)胞PLGF、HGF及VEGF mRNA相對表達量均高于常氧組細(xì)胞(P均<0.05)。

2.3 低氧預(yù)處理ADSCs移植對心肌梗死小鼠心肌細(xì)胞凋亡及血管新生的影響 細(xì)胞移植后4周，組織免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)心肌梗死邊緣區(qū)caspase-3陽性凋亡細(xì)胞每高倍視野模型組為(23.66±5.75)個，常氧ADSCs移植組為(15.83±5.45)個，低氧ADSCs移植組為(9.74±3.22)個，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。心肌梗死邊緣區(qū)vwF陽性血管內(nèi)皮細(xì)胞每高倍視野模型組為(11.35±4.76)個，常氧ADSCs移植組為(18.95±4.55)個，低氧ADSCs移植組為(25.65±5.54)個，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

3 討論

MSCs移植對心肌梗死具有明確的治療作用，但其具體機制尚未完全闡明。目前研究顯示其可能機制包括：MSCs分化成心肌細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞替代作用、MSCs分化內(nèi)皮細(xì)胞促使損傷區(qū)血管再生、通過旁分泌功能分泌細(xì)胞因子促進心功能恢復(fù)等[3, 5]。且多數(shù)研究認(rèn)為MSCs的旁分泌功能可能起主要作用。本研究顯示，ADSCs移植可下調(diào)心肌梗死邊緣細(xì)胞凋亡反應(yīng)，促進新生血管再生，低氧預(yù)處理可提升ADSCs旁分泌功能，進一步發(fā)揮其對心肌梗死區(qū)周邊細(xì)胞凋亡、血管再生的調(diào)控作用。

血管再生是心肌梗死后心功能恢復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。VEGF、PLGF是與血管再生密切相關(guān)的細(xì)胞因子，其中PLGF是損傷病理狀態(tài)下血管再生決定性因子[6]。研究顯示，在骨髓MSCs移植修復(fù)小鼠心肌梗死中，利用攜帶shVEGF和shPLGF的慢病毒質(zhì)粒，敲低干細(xì)胞VEGF和PLGF的表達，發(fā)現(xiàn)下調(diào)PLGF而非VEGF時，心肌梗死小鼠心功能受影響，證實PLGF是介導(dǎo)心肌梗死后血管再生的關(guān)鍵因子[7]。因此，提升ADSCs分泌PLGF等因子的功能是提高干細(xì)胞移植修復(fù)心肌梗死的重要策略。目前，通過基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)染相關(guān)基因后再移植、藥物預(yù)處理、組織工程制備細(xì)胞聚合物、低氧預(yù)處理等措施[8, 9]均是人們提升ADSCs分泌血管再生因子功能的嘗試。由于氧濃度是影響細(xì)胞代謝的關(guān)鍵因素，低氧對MSCs增殖、分泌有重要影響，且低氧操作相對簡單，故細(xì)胞低氧預(yù)處理備受關(guān)注。研究證實，低氧(5% O2)預(yù)處理MSCs顯著提升細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子1-α表達，促進MSCs增殖[10]。本研究顯示，低氧組ADCSs Ki67陽性表達率高于常氧組，說明低氧處理后ADSCs增殖活性顯著提升。本研究也顯示，低氧ADSCs移植組 PLGF、HGF及VEGF mRNA相對表達量提升，小鼠心肌梗死周邊vwF陽性血管數(shù)量較模型組和常氧ADSCs移植組增多，低氧ADSCs移植組小鼠凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著下降。此對小鼠心肌梗死后心功能恢復(fù)有重要作用。

生理狀態(tài)下，人體不同組織氧含量為2%～7%，心肌梗死后梗死區(qū)及梗死周邊處于無氧或嚴(yán)重缺氧狀態(tài)，氧含量為0.4%～2.3%，不利于細(xì)胞存活[11]；其次，損傷后大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等浸潤，缺氧、炎癥進一步導(dǎo)致大量細(xì)胞壞死、凋亡。研究證實，低氧預(yù)處理后干細(xì)胞氧耗量是常氧細(xì)胞的1/3，可提升MSCs對宿主損傷局部缺氧環(huán)境的適應(yīng)能力。有研究顯示，采用低氧預(yù)處理骨髓MSCs移植治療大鼠糖尿病缺血肢體可促進損傷區(qū)血管再生及組織恢復(fù)[12]；低氧預(yù)處理MSCs移植在腦卒中[13]、肺損傷[14]、腦損傷[15]等疾病模型中均可發(fā)揮積極修復(fù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，利用低氧預(yù)處理ADSCs條件培養(yǎng)液治療心肌梗死大鼠，低氧預(yù)處理可顯著提升條件培養(yǎng)基中VEGF、HGF、基質(zhì)細(xì)胞來源因子濃度，降低損傷周邊凋亡細(xì)胞數(shù)量，改善大鼠心功能[16]。低氧預(yù)處理能增強MSCs分泌缺氧誘導(dǎo)因子1α、VEGF、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1、磷酸化Akt等因子的表達，增強 MSCs在缺血心肌組織中的存活及分泌功能，減少細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的生成，促進大鼠缺血壞死心肌的修復(fù)[17]。

綜上所述，低氧預(yù)處理增強ADSCs增殖活性，提升細(xì)胞VEGF、HGF、PLGF mRNA表達水平，低氧預(yù)處理ADSCs移植治療心肌梗死小鼠可促進梗死邊緣新生血管再生，下調(diào)凋亡細(xì)胞數(shù)量，可能是未來治療心肌梗死的新策略。