大鼠血管平滑肌細胞IκB激酶2對血管舒縮調控的作用及機制

李袁靜，高凌云，楊昌軍，蔡明

(1重慶醫科大學附屬第一醫院，重慶400006；2美國俄亥俄州立大學心肺研究中心)

血管平滑肌細胞是一類具有高度特異性的細胞,主要功能是通過收縮和舒張作用調節血管腔大小，進而影響血流量及血壓，其舒縮調控機制與細胞肌球蛋白輕鏈(MLC) 第19號絲氨酸的磷酸化水平相關。已經證實，肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)磷酸化作用對機體血壓的調節有重要影響[1]。但除MLCK外，越來越多的研究表明還存在對細胞MLC有磷酸化作用的其他激酶存在。當平滑肌細胞缺乏促收縮因素或使用MLCK抑制劑，細胞內仍有較低水平的MLC磷酸化。IκB激酶2(IKK2)是NF-κB活化的重要激酶[2,3]，可磷酸化多種底物并參與細胞增殖、遷移、胰島素敏感性改變等多種細胞反應[4,5]。最近研究發現，IKK2抑制劑包括化學物或抑制肽均有血管舒張作用，IKK2對血壓改變可能有重要影響。為尋找高血壓防治新靶點，2014年12月～2016年3月，我們就IKK2對血管舒縮的調控作用進行了研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料 16周齡SD大鼠(重慶醫科大學動物中心提供，實驗獲重慶醫科大學附屬第一醫院實驗動物倫理委員會審核)，MLC小鼠抗體(Ser19，Cell Signaling Technology)，抗MLC小鼠抗體(Sigma)，兔抗IkBa(Cell Signaling Technology)，actin單克隆抗體(Sigma)，flag小鼠抗體(Sigma)，兔抗IKK2(Sigma)，兔抗IKK1(Sigma)，兔抗Zip激酶(Abcam),兔抗ILK(Abcam)，小鼠抗NEMO(Cayman Chemicals)，小鼠抗磷酸化IkBa(Ser32/36，Cell Signaling Technology)，小鼠抗RhoA(BD Transduction Laboratories)和兔抗IKKα/β(Ser176/Ser180，Cell Signaling Technology)，HTScan激酶測量試劑盒(Cell signaling technology)。

1.2 去內皮胸主動脈環制備 將SD大鼠用戊巴比妥鹽水麻醉，迅速切取胸主動脈并用 PSS洗凈。將主動脈切成2 mm寬環狀，并通過機械摩擦的方式移除血管內皮。血管環用兩根不銹鋼微型掛鉤貫穿血管管腔，水平懸掛于10 mL浴漕內，下方固定，上方以一細鋼絲連于張力換能器，經Multi Myograph System計算機生物信號采集分析系統記錄血管的張力變化。每個血管環懸掛于浴管(浴管內含有95% O2和5% CO2、37 ℃的PSS液10 mL)后，基礎張力調至30 mN，平衡1 h。動脈環用80 mmol/L KCl液多次刺激。當達到坪值后，加入乙酰膽堿(10 μmol/L)。舒張幅度不超過收縮幅度的5%時，認為胸主動脈內皮去除完全。

1.3 IKK2抑制劑對胸主動脈環舒張效應檢測 觀察除血管內皮的大鼠主動脈環由血管收縮劑(去氧腎上腺素、KCl、U-46619、離子霉素、花萼海綿體誘癌素A)預處理，然后分別加入10 μmol/L IMD0354、30 μmol/L SC-514。設置IKK2抑制多肽對照組。采用Multi Myograph System計算機生物信號采集分析系統記錄血管張力變化。

1.4 MLCK抑制劑對IKK2磷酸化影響檢測 將MCL與1 mmol/L的EGTA(為MLCK抑制劑)或對照組中分別加入25 nmol/L的IKK2、25 nmol/L的MLCK共孵育1 h，通過Western blotting檢測MLC第19號絲氨酸的磷酸化水平。

1.5 IKK2抑制劑SC-514的舒血管效應可逆性檢測 根據上述實驗制備的動脈血管環預先使用去氧腎上腺素1 μmL處理，然后用SC-514舒張血管。設置IKK2抑制劑SC-514組和空白對照組。充分沖洗后，經Multi Myograph System計算機生物信號采集分析系統記錄血管張力變化。

2 結果

2.1 IKK2抑制劑對胸主動脈環的舒張效應 IMD-035為IKK2選擇性抑制劑，其對KCl、去氧腎上腺素、U-46619、離子霉素、花萼海綿體誘癌素A縮血管預處理的動脈作用10 min后，血管張力分別為55.3%±1.2%、47.0%±3.5%、61.2%±4.4%、37.5%±1.9%、41.0%±2.7%，與對照組(7.4%±0.9%)比較均有統計學差異(P均<0.05)。SC-514是IKK2的競爭性抑制劑，對去氧腎上腺素和KCL預處理的動脈同樣有舒血管效應，血管張力分別為48.7%±3.9 %、32.1%±2.8% ，與對照組(9.4%±1.1%)比較均有統計學差異(P均<0.05)。

2.2 MLCK抑制劑對IKK2磷酸化的影響 對照組、MLCK組、IKK2組、EGTA組、MLCK聯合EGTA組、IKK2聯合EGTA組MLC磷酸化水平分別為1.04±0.03、1.96±0.03、1.72±0.07、0.61±0.03、1.06±0.04、1.70±0.03。MLC在MLCK 、IKK2作用下磷酸化程度增加，EGTA可降低MLCK對MLC的磷酸化水平，IKK2對對MLC的磷酸化活性不被EGTA所抑制。組間比較差異有統計學意義(P均<0.05)。

2.3 SC-514舒血管效應的可逆性 SC-514組SC-514濃度較低時(5 μmol/L)血管張力為77.5%±2.2%，對照組為76.1%±3.1%，兩組比較無統計學差異(P>0.05)。增加SC-514濃度至15 μmol/L時血管張力為49.0%±2.7%，對照組為63.5%±1.8%，兩組比較有統計學差異(P<0.05)。25 min后對兩組大鼠主動脈環進行充分沖洗后再以去氧腎上腺素1 μmL處理，SC-514組、對照組血管張力分別為72.6%±3.2% 、74.1%±1.1%，兩組比較無統計學差異(P>0.05)。表明SC-514對血管的舒張效應是可逆的。

3 討論

目前已證實，除MLCK外還有多種激酶對MLC 第19號絲氨酸具有磷酸化作用，如Rho激酶、ILK、PAK和ZIPK。但關于這些激酶對血管平滑肌細胞MLC磷酸化作用尚存在爭議。體外實驗發現，使用Rho激酶抑制劑Y-27632對由花萼海綿體誘癌素A誘導的血管收縮和MLC的磷酸化并無拮抗作用，說明Rho激酶在血管平滑肌細胞中不是必需的MLC磷酸化激酶[6～9]。AV25和SM1是ZIPK的強效抑制劑，但它們并不能拮抗由肌球蛋白輕鏈磷酸化酶(MLCP)抑制引起的血管平滑肌收縮，從而排除ZIPK是血管平滑肌細胞中一類重要的MLC磷酸化激酶[10]。在哺乳動物中PAK分為6種，對其中研究最深入的是PAK1，并已證實其在神經細胞、乳腺癌細胞、HeLa細胞和肺內皮細胞中對MLC具有磷酸化作用。但沉默PAK1可誘導肌上皮細胞收縮，而不是舒張效應[11]。對豚鼠血管平滑肌細胞的研究發現，PAK1通過磷酸化可誘導血管舒張，進而抑制MLCK活性[12]，這說明PAK1可能不是血管平滑肌細胞中重要的MLC磷酸化激酶。在食管平滑肌細胞中，通過使用Okadaic酸抑制MLCP活性時可顯著增強ILK活性；相反，當使用ILK抗體時可抑制由Okadaic酸所產生的細胞收縮，這些現象說明ILK在細胞內具有MLC磷酸化激酶活性[11]。

研究顯示，IKK2是一類重要的磷酸化激酶[13]。為此，我們采用體外主動脈環實驗進一步檢測了IKK2對MLC的磷酸化激酶活性。我們體外實驗初步通過IKK2抑制劑預處理小鼠，觀察對肌肉微血管的舒張作用，結果證明IKK2是MLC一類重要的縮血管激酶。其中IKK2抑制劑IMD-0354對胸主動脈環的舒張效應研究發現，IMD-0354可顯著減輕由各種縮血管因素引起的主動脈環的收縮，包括去氧腎上腺素、KCl、U-46619、離子霉素、花萼海綿體誘癌素A。IKK2抑制劑SC-514可通過對血管平滑肌細胞的凋亡作用產生舒血管效應，且其對血管的舒張作用可完全被逆轉，從而排除SC-514對血管的舒張效應是通過降低血管平滑肌細胞活性所致。此外，已有文獻報道IKK2抑制劑可誘導多種細胞凋亡的發生[14]。

綜上所述，除MLCK外還有多種激酶對MLC第19號絲氨酸具有磷酸化作用，這些激酶主要有Rho激酶、ILK、PAK和ZIPK。但關于這些激酶對血管平滑肌細胞MLC磷酸化作用尚存在爭議，且支持這些激酶在血管平滑肌細胞中有類似作用的證據極少。本研究證實IKK2亦具有MLCK縮血管作用的磷酸激酶活性，其抑制劑有舒血管作用。