磁流體熱療治療腫瘤的研究進展

胡潤磊 江洪 馬勝林

杭州市第一人民醫院（杭州310006）

加熱被記載在醫學領域用來治療疾病已有一個多世紀了［1］。根據溫度的高低可以將熱療分為熱消融（ther?moablation）和高熱療法（hyperthermia，HT）兩種熱療方式［2］。熱消融在臨床上作為去除腫瘤的一種手段類似于手術切除腫瘤一樣，通常定義為熱療的溫度在50℃以上，利用致命水平的熱凝固造成不可挽回的蛋白質和其他生物分子的損傷，從而誘導細胞死亡。HT通常定義為溫度在41～50℃之間，通過限制一些腫瘤細胞的微觀結構功能導致腫瘤細胞凋亡和壞死，而周圍正常的組織沒有損傷的一種熱療方法。治療的效果與溫度的持續時間、腫瘤區域溫度的同質性、腫瘤組織的均一性等因素有關。研究發現，即使在41～42℃的條件下作用1 h，也可以引起明顯的腫瘤凋亡、導致壞死［3］。熱療導致腫瘤細胞凋亡和壞死的機制如下：（1）熱療可使腫瘤區域內血流加速（而不是正常組織）從而導致增加灌注和氧合，而腫瘤區域的血管畸形，加速了腫瘤細胞的缺氧，特別是腫瘤中心區域的細胞由于缺氧而引起酸中毒加重，從而造成腫瘤細胞凋亡和壞死［4］；（2）熱療引起細胞周期的變化，從而導致細胞的凋亡壞死；（3）熱療可以引起腫瘤細胞釋放腫瘤壞死相關因子抗原，進而引起腫瘤的宿主免疫反應，特別是T細胞免疫反應，從而引起腫瘤細胞的生長抑制。（4）除了腫瘤的生理和微環境的水平，在分子水平上，熱療可以導致蛋白質包括細胞骨架結構，質膜組件，細胞內酶和信號轉導分子，熱休克蛋白編排、重折疊，以及破壞受損蛋白質與DNA修復相關的蛋白質等因素來導致腫瘤細胞凋亡、壞死［5］。（5）熱療與放療、化療有協同作用，可以增強放療、化療的抗腫瘤效果。綜上所述，理想中的熱療目的是利用最低限度提高的溫度來改變靶區腫瘤組織的生理和生物學改變，從而獲得較其他方法（如化療或放療）更加有效的一種治療方法［6］。

熱療可以引起抗腫瘤作用是WILLIAM COOLEY醫生首次發現。研究發現，感染引起發熱的腫瘤患者腫瘤明顯消退。從此，熱療開始進入腫瘤的治療領域［7］。研究發現，熱療作為一種新的腫瘤治療方法，它與其他方法聯合應用，可能比單獨在腫瘤中的應用效果更好。大量臨床試驗證明，溫和溫度下熱療可以安全地管理患者并取得患者的臨床獲益，可以明顯改善腫瘤的局部控制，緩解癥狀，甚至提高總體存活率［8］。盡管報道的熱療在癌癥的療效較為滿意，但是熱療在臨床中還是未被廣泛使用，主要有以下原因：機體深部腫瘤的介入方法實施難度大，風險大；熱療過程中的難以維持有效熱療所需的溫度；熱療的患者缺乏監測和后勤保障；因此導致熱療未在臨床廣泛應用的根本原因是熱療的效果和接受度在臨床未被廣泛認可。

1 傳統的熱療方法

目前已有多種熱療的技術在臨床上應用，包括電磁輻射（如激光、微波和射頻）以及高強度超聲聚焦。根據身體的接觸熱的范圍，我們將熱療分為3種類型。全身熱療（whole body HT）、區域熱療（regional HT）以及局部熱療（local HT）。全身熱療主要是通過熱水毯子和熱室的溫度來實現的。而區域熱療包括有腫瘤的灌注患者的部分軀體，通過對患者的腫瘤區域血流溫度的升高以及體腔局部溫度的升高來達到治療的目的，如臨床上通過腹膜腔的的灌注加熱和抗癌藥物的局部應用來控制腹膜惡性間皮瘤［9］。但是這些方法對腫瘤特異性不高，在技術上具有挑戰性，臨床上需要多次加熱才能提高治療效果。

局部熱療方法在臨床上應用對腫瘤具有一定的特異性；加熱過程中使用定制的探針放置在腫瘤內部或接近腫瘤從而實現對腫瘤的相對均一加熱。但是熱療過程中放置在腫瘤外部加熱源通常是侵入性的，對較大的腫瘤通常會導致加熱不均勻。理想中的熱療方法應該是在腫瘤區域特異性高，微創以及在腫瘤組織中具有較高的熱均一性。

2 磁性粒子介導的磁流體熱療

磁流體熱療（magnetici fluid hyperthermia，MFH），就是將磁性納米粒子通過特定的方式導入到腫瘤內部，然后放置在交變磁場中，磁性粒子在交變磁場的作用下作為致熱源產熱，從而到達治療腫瘤的目的。MFH主要包括3個部分：進入到腫瘤區域的磁性納米粒子的制作；納米粒子如何導入到腫瘤內部；交變磁場的作用強度和頻率［10］。目前磁流體熱療主要有以下3種方式［11］：動脈栓塞熱療（arterial embolization hyperthermia，AEH），磁性納米粒子通過特定的介入法，經過腫瘤的滋養動脈進入到瘤體內部，進而在交變磁場下發熱升溫。直接注射熱療（direct injec?tion hyperthermia，DIH）將磁性粒子通過直接注射的方法進入腫瘤內的磁熱療方法。細胞內熱療（intracellular hyperthermia，IH），體外對磁性粒子進行對腫瘤具有趨向性的抗原介質的修飾，抗原介質和磁性粒子有效的結合，這些抗原介質將磁性粒子攜帶至腫瘤內部進行磁熱療的一種方法。由于MFH中的磁性粒子具有分散好、容易到達腫瘤區域的特點，理論上是一種十分理想的腫瘤熱療方法，具有很好的特異性和靶向性。

2.1 磁性納米粒子研究進展由于MFH是通過磁性粒子的產熱來實現的，因此，磁性納米粒子的形態、結構以及磁飽和度等因素對MFH的實施至關重要。經過長期的研究和探索，目前能夠利用當今先進的科學和技術來合成顆粒大小、粒徑分布、形狀和形態良好的納米磁性粒子，目前主要有兩大主流的合成方法，化學合成和生物合成［12］。

2.1.1 化學合成方法化學合成法在磁性粒子的合成過程中發揮了重要的作用，化學合成的優點是它的多功能性設計和合成新材料，可以完善成最終的產品。主要優點是化學均勻性好，化學合成提供了在分子水平上的混合。目前主流的是化學共沉淀技術，可以從最簡單、最有效的化學途徑來獲取磁性粒子，其主要優勢是可以合成大量的納米磁性粒子。然而粒度分布的控制是有限，因此，此種方法面臨的最大挑戰是控制粒子的大小以及粒徑的分布［13-14］。

另一種常見的方法是水熱合成法，在近期的文獻中有報道。主要是將鐵酸鹽通過水熱條件水解和氧化或混合金屬氫氧化物的中和來實現的，納米粒子大小的形成與水熱的溫度有明顯的相關性，因此對技術要求較高［15］。

此外，還有其他方法，如多元醇方法，燃燒合成法，溶膠凝膠制備等方法，由于這些方法在化學領域有較多的應用，故不再詳細綜述［16-17］。化學合成是一種非常有前途的的納米顆粒合成技術。

2.1.2 生物合成法如上所述，物理化學方法已經成功地應用于生產納米磁性粒子。然而，這些方法合成的粒子可能有化學毒性。因此與理想中的無毒、粒子分布均勻、均一的特點有一定的差距。

納米顆粒的生物合成主要有細胞內和細胞外兩種途徑。趨磁細菌合成是一種重要的細胞內途徑方法，此種顆粒組成的單一的納米晶結構，這些晶體化學結構均勻，擁有一個明確的形態和封閉的蛋白質嵌入脂質雙分子層，稱為磁小體［18］。其可以有效地嵌合磁性納米粒子，形成磁性納米晶體［19］。

2.1.3 磁性納米粒子的生物相容性磁性粒子在進入實驗或臨床研究前，一個至關重要的因素就是它的生物相容性。生物相容性好壞直接影響其在未來的藥物治療、接受者的治療方面的進一步應用研究。理想的生物相容性材料應該具有以下特點：（1）置入到體內的材料能夠在體內保持很長一段時間。（2）治療完成后，這些磁性粒子能夠從機體完全清除。因此，決定磁流體熱療的關鍵因素之一就是磁性粒子的毒性以及磁性粒子表面的涂層材料。

磁性粒子表面的涂層材料的毒性視情況而定，與許多因素有關，包括劑量、化學成分、合成方法、大小、生物降解性、藥物動力學、生物分布、表面化學、形狀結構等。一般來說，粒子大小、面積、形狀、組成和涂層等方面對細胞毒性影響最大，粒子的表面積越大，生物相容性會越差［20］。

2.2 磁流體熱療治療腫瘤的研究進展磁流體熱療在腫瘤領域取得較快的進展，主要集中在磁性粒子的合成，磁性粒子的特征以及發熱能力。近年來，相關的研究進展主要集中在進入臨床試驗前的相關磁性納米粒子的細胞毒性，MFH在體內和體外抗腫瘤實驗的的相關研究。

2.2.1 體外實驗研究體外實驗研究主要集中在熱介質在磁場的發熱性能，腫瘤細胞株和磁場強度等方面的選擇。體外實驗的結果直接影響體內實驗以及進入臨床的前期試驗研究。為了驗證交變磁場對細胞有無影響，學者進行了深入研究。他們將直徑為15 nm大小的葡聚糖涂層的Fe3O4磁性粒子與樹突狀細胞（DC）進行了標記，在交變磁場AMF（f=260千赫，0＜H0＜12.7 kA/m）從5～15 min間隔進行作用，檢測磁場是否對樹突狀細胞有影響。結果證實，一定強度的磁場條件對DC的影響不大，從而說明通過控制磁場強度可以保護正常的組織細胞活性。

研究發現，納米磁性粒子本身對細胞活性，細胞膜完整性、細胞凋亡和增殖有一定的影響。通過磁性粒子表面的涂層材料可以降低此方面的影響。因此在進入實驗和臨床前期研究之前，選擇合適直徑的磁性粒子，有效的粒子表面涂層，對提高生物相容性至關重要［21］。

基于磁性納米的有效選擇，國內外學者進行了體外細胞實驗，將Fe3O4納米磁流體在體外與A549肺癌細胞共培養，在交變磁場下進行了作用。研究證實，Fe3O4在交變磁場的作用下可以升溫至42℃以上，能夠抑制肺癌A549細胞的增殖，誘導肺癌細胞凋亡，阻滯細胞周期S期。國內學者對膠質瘤、肝癌細胞同樣進行了相關研究，結果同樣令人振奮［22］。

2.2.2 體內實驗研究基于磁流體熱療在體外的成功研究，學者們進行了大量的體內動物實驗研究。主要研究方法將磁性粒子通過直接注射熱療和動脈栓塞熱療。RENARD等［28］將超順磁的鐵氧化物 NPs（SPIONs）嵌入在二氧化硅微粒子凝膠中，通過直接的方法注射到乳腺導管癌CB17 SCID小鼠移植瘤中，外加磁場的磁場強度9 660/m、頻率144 Hz。結果表明，植入物的物理特性和微觀結構可以通過選擇一個合適的聚合物和定制的溶劑組合影響來增加加熱能力［23］。

研究發現，納米粒子在體內的生物分布也是影響磁流體熱療的一個重要的方面。GUTIERREZ等［29］將DMSA?MNP（300 μg Fe/mL）注入C57BL/6小鼠體內，每周2次，2周后在最后一次注射后1 h將小鼠安樂死。結果發現，只有10%的注入量的在小鼠的組織中被檢測到，其余的粒子可能被代謝或經器官排泄出體外。他們的研究結果表明磁性納米粒子表面的吸附劑改變了其生物分布，從而減少NPs的存在，降低了磁性納米粒子的毒性［24］。

LEE等［25］研究發現，磁流體中納米磁性粒子的形狀分布對磁場產熱也有較大的影響。將不同耦合CoFe2O4@Mn?Fe2O4的磁性粒子注射到人腦腫瘤U87MG小鼠移植瘤內部，交流磁場（500 kHz、37.3 kA/m）作用10 min。連續觀察18 d，結果發現，核心——殼牌納米磁性粒子組腫瘤完全消失，而另一組包裹藥物（阿霉素）在26 d后再次逐漸長大。進一步進行劑量研究比較核殼納米粒子的影響，發現磁性粒子劑量為75 mg組的腫瘤完全消除，需要實現相同的結果，阿霉素組需要300 mg的劑量。MARTINEZ?BOU?BETA等［26］也報道立方顆粒有較大的各向異性，與球形粒子相比，表面各向異性的有益作用提高了加熱功率。

此外，納米磁性粒子的合成方法也會影響細胞毒性以及加熱能力［27］。近年來，有學者對新的生物磁性材料——細菌磁小體（bacterial magnetosomes，BMs）進行了研究，證實BMs是一種在磁流體熱療應用中非常有發展前景的熱介質材料。將BMs注入到Bal/c小鼠體內，放置在300 kHz的頻率和場強度110 Gs交變磁場下作用。結果發現，BMs實驗組中所有老鼠活了下來，只有1只小鼠注射BMs后略有不安，但是在4 d后完全恢復。

2.2.3 臨床前研究盡管磁性納米粒子熱療的前期工作有較多的研究，磁性粒子的合成、生物相容性、粒子的毒性以及動物實驗有了較快的進展，但是還沒有進入臨床應用。這可能是由于當前一些技術的限制，如粒子在腫瘤部位特異性差，分布不均勻以及控制熱量在腫瘤分布等。在所有研究的粒子中，Fe3O4和γ-Fe2O3已經被用于臨床前實驗研究，因為這些材料已經被證明顯示低毒性及其代謝途徑非常明確。為了成功建立磁流體熱療的臨床治療裝置，德國的MagForce納米公司設計了一個交變磁場發生（MFH 300 FTM），這個磁場可以產生100 kHz、0～18 kA/m的磁場強度。它可用于治療人體任何位置惡性腫瘤［28］。

大多數的臨床前試驗是在兩種腫瘤患者中進行的，即腦部腫瘤和前列腺癌。2003年3月，MAIER HAUFF等［29］進行了第一個臨床實驗，對14例患有原發性多形性膠質母細胞瘤（GBM）的終末期患者進行治療?；颊呷虢M標準如下：年齡≥18歲；預期壽命＞3個月；腫瘤直徑＜5 cm；沒有多腔的增長，沒有金屬材料在腫瘤附近。所有患者接受瘤內注射并接受4～10次的磁流體熱療，每次熱療時間為1 h，結果發現，腫瘤內溫度達到42.4℃，患者的治療耐受性良好。2009年，LANDEGHEM等［30］報道3例患者在研究過程中由于疾病進展而去世，通過尸檢發現，磁性粒子分散腫瘤細胞壞死區域，范圍局限在注射的范圍。2010年，MAIER?HAUFF等［31］進行了另一個臨床研究，對59例復發膠質母細胞瘤患者進行放療結合磁流體熱療，這項研究結果同樣證明，磁流體熱療結合分次立體定向放射治療在臨床上是有效的，能延長患者總的生存率。

2005年，JOHANSSEN等［32］對一位67歲放療復發的前列腺癌患者進行試驗性治療，結果發現，在腫瘤內部可以達到有效的溫度范圍。在隨后的一個臨床試驗中，通過直接注射法對一組復發性前列腺癌患者進行治療，患者接受每周6次，每次60 min的熱療，磁場強度為4～5 kA/m，結果發現，90%的前列腺區域溫度可以升高至38.8～43.4℃，在隨后的隨訪研究中發現，腫瘤區域的磁性粒子在17.5個月仍可檢測到，臨床觀察未見系統性毒性［33］。

到目前為止，這項技術的限制因素是在高頻磁場的舒適性差和腫瘤內部不規則熱量分布。相比之下，納米磁性粒子在前列腺區域的沉積持久性較好［34］。如果上述局限性得到解決和克服，那么磁流體熱療就可以安全地和放射治療相結合，在前列腺癌患者的治療中將發揮重要的作用。

3 存在的問題及展望

盡管磁流體熱療在惡性腫瘤的治療中具有很多的潛在發展前景，體外和體內實驗結果令人振奮，但是在進入臨床治療中還有很長一段路要走，很多細節工作需要完善。首先是粒子如何精確導入到腫瘤內部的技術問題，目前我們實驗研究以及臨床前的治療試驗多是經過直接注射的方法來完成的，從而導致粒子在腫瘤內部升溫不均勻。盡管有學者通過腫瘤的滋養血管來導入粒子到腫瘤內部，理論上能使粒子在瘤體內均勻分布，但是，實際上對于較大的腫瘤，瘤體內部深處的血管相對貧乏，從而也會導致粒子分布不均，如何解決這一問題，需要更加深入的研究。

第二個存在是問題是納米粒子質量控制問題。目前我們實驗用的納米粒子合成方法有多種多樣，表面包裹不同的涂層，使納米顆粒的成分越來越復雜。多變的粒子成分會造成粒子直徑的測量準確性下降。從而導致粒子的物理測量參數下降。因此，需要制定統一的粒子制作和測量方法。

第三個存在的問題是納米粒子的生物相容性。納米粒子的毒性主要有兩個方面：一個直接的毒性；另一個是納米顆粒保留在體內的延遲毒性。直接的毒性可以通過動物實驗來檢驗。目前學者研究的多數鐵氧化物納米磁性粒子，實驗證實生物相容性好。但是也有報道其他的磁性納米顆粒（金、碳納米管等），仍需要進一步探索期生物相容性。

總之，納米粒子介導的磁流體熱療作為一種新型的熱療方法，實驗研究證實明顯優于傳統的熱療方法。研究過程中如果解決了納米粒子的毒性評估，優化粒子性能使其能在瘤體內均勻分布以及有效的沉積在腫瘤內部等問題，有理由相信，它在不久的將來將真正成為腫瘤治療的綠色方法，造福廣大腫瘤患者。

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