錨蛋白G對心臟鈉通道影響的研究進展

劉劍，顏素娟

(南昌大學第二附屬醫院，南昌330006)

在心肌細胞中離子通道和運載體的調節活動對正常的興奮收縮偶聯和心臟收縮節律來說非常重要。過去研究表明，具有調節離子通道的生物物理學特性的人類基因變異與致命性心律失常有著緊密的聯系。錨蛋白是一類鏈接蛋白，在心血管系統中，錨蛋白是離子通道和運載體信號復合物的重要組成部分；在興奮性細胞中，錨蛋白對鈉離子通道(Nav)和運載體的正確表達及膜上的定位起關鍵作用。最近研究表明，對Nav定位有影響的錨蛋白G為基礎的途徑基因變異與Brugada綜合征的致命性心律失常有關。在發生心肌梗死犬的心臟梗死邊界區的心肌細胞中，錨蛋白G參與鈉電流(INa)的重構。這些研究都表明這些重要的分子事件在可興奮細胞中參與了細胞膜域的構成。甚至，把心臟“通道疾病”引起的心律失常歸因于適宜的通道靶向性和定位的缺陷。而離子通道的靶向性和定位與錨蛋白G又有不可分割的關系。現將錨蛋白G對心臟鈉通道影響的研究進展綜述如下。

1 錨蛋白生物學特性

錨蛋白是一種胞內蛋白，其能構成、轉運和定位膜蛋白復合物到肌動蛋白或血影蛋白細胞骨架上,從而，在具有明顯功能特征的膜里形成微結構域。在錨蛋白家族中，常見的蛋白主要有：錨蛋白R、錨蛋白B、錨蛋白G。典型的錨蛋白及其不同的剪接變異體主要由三種互為獨立的基因(ANK1，ANK2和ANK3)編碼。ANK1位于人染色體8p11上，主要編碼錨蛋白R。ANK1主要在紅細胞和一些肌肉與神經元上表達[1]。ANK2位于人染色體4q25-27上，主要編碼錨蛋白B。ANK2主要在大腦、心臟、胸腺上表達[2]。ANK3位于人染色體10q21上，主要編碼錨蛋白G。ANK3主要在大腦、腎臟、骨骼肌和心臟上表達[3]。典型的錨蛋白有四種結構域組成。它們分別是膜結合域(MBD)、血影蛋白結合域(SBD)、死亡域(DD)和C-末端(CTD)。錨蛋白MBD是由24個ANK基因的重復序列構成，并形成連續的螺旋樣結構。MBD并不直接與細胞膜結合，而是通過與多種膜蛋白結合。這些膜蛋白通常有：離子通道，運載體及細胞黏附分子。MBD的功能是由ANK重復序列進行調控。重復序列形成許多反向平行的α-螺旋結構，并通過β-轉角環尖的垂直排列與這些α-螺旋結構發生聯系[4]。這些被暴露的環尖對錨蛋白與膜蛋白間的相互作用具有特異性。如 1， 4，5-三磷酸肌醇受體與編碼220 kD錨蛋白-B的ANK重復序列22-24的β-轉角環尖的相互作用[5]。同時MBD能與不同的膜蛋白進行結合，并形成多種膜蛋白復合物。又如錨蛋白-R膜結合域對L1細胞黏附分子神經束蛋白有2個結合位點[6]，這些結合位點能調控錨蛋白R與陰離子交換劑的二聚物相互作用[6]。錨蛋白SBD是一個大小為62 kD的結構區域，也是錨蛋白的結構中心。具有對錨蛋白和以血影蛋白或肌動蛋白為基礎的細胞骨架的調節功能。研究表明，錨蛋白和β-血影蛋白間的相關性可能與錨蛋白對血影蛋白/肌動蛋白的細胞骨架結構的維持作用有關。如在小腦神經元里隨著錨蛋白G的表達受到破壞，β4-血影蛋白含量發生減少[7]。錨蛋白DD是一個含有90個氨基酸構成的結構區域，具體的功能尚不清楚。但被認為DD可能促進同型蛋白與異型蛋白間聯系作用。在腎小管里錨蛋白G的死亡域與促凋亡分子Fas有相互作用關系[8]。錨蛋白CTD在不同的錨蛋白基因產物中的含量是有差別的，并且CTD對錨蛋白基因產物的調控具有十分重要的意義。如缺乏161殘體錨蛋白-R的剪接變異體對血影蛋白及陰離子交換劑的親和力要比其全長度的高[9]。

2 錨蛋白G依賴性細胞途徑

在神經細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞的電活動中都需要Nav。在心臟Nav1.5是最主要的Nav。Nav1.5依賴性活動具有調節心臟動作電位快速去極化過程。Nav1.5的活動需要精確地定位于特定的心肌細胞膜結構上。而錨蛋白G MBD與Nav1.5 DⅡ～DⅢ環的直接相互作用是Nav1.5表達和定位于心肌細胞膜表面上的基礎。對于心肌細胞和其他可興奮性細胞來說，錨蛋白G依賴性Nav1.5靶向定位是興奮產生過程中必不可少的一步。錨蛋白肽通過與心臟動作電位相關的靶向性關鍵性離子通道或運載體來規律地調控心臟活動。錨蛋白G直接與Nav1.5靶向于膜表面來調節內流的INa有關，并與動作電位開始和心肌細胞的去極化有關。此外，Prosenjit等使用慢性腸道炎癥的兔子模型研究發現，在慢性腸道炎癥過程中，Na-K ATP酶的定位發生改變后就會引起錨蛋白G的下調。而錨蛋白G的下調將導致Na-K ATP酶活性下調[10]。在心肌細胞中錨蛋白G是Nav1.5生理學意義上的結合“伙伴”。研究表明，錨蛋白G減少的心肌細胞表現出Nav1.5的表達減少，膜上定位異常以及Nav電流密度減少[11]。通常把這種結構上的需求定義為錨蛋白G對Nav1.5的相互作用。同時Nav1.5細胞膜上的定位異常是由于Nav1.5-錨蛋白G間相互作用的消失。錨蛋白G對心臟的去極化及可興奮性組織上Nav活動起著關鍵性作用。

3 錨蛋白G對心肌細胞興奮性的調節

通過對各種離子通道和運載體的聚集，錨蛋白G對神經元和心肌細胞的膜興奮性進行支配。而最新研究顯示，錨蛋白G通過胱氨酸的棕櫚?；瘜⒆陨矶ㄎ挥诩毎|膜上特定區域。錨蛋白G的膜錨定是通過棕櫚?；雍系街|膜上并形成一個穩定的結合界面，而無棕櫚酰化的錨蛋白G更傾向于待在膜附近，但沒有形成一個獨立的結合面。在近膜區錨蛋白G通過胱氨酸的棕櫚酰化后接受脂質的調控，此過程一旦發生，錨蛋白G就形成了一個嚴格的結構基礎，在此基礎上可以形成膜激發平臺[12]。 Nav對心臟的動作電位快速上升期和心臟的傳導功能有十分重要的意義。Nav1.5在心肌潤盤上的表達能促進動作電位的產生。Scn5a是編碼Nav1.5主要基因，當Scn5a變異和(或)Nav功能障礙都會引起一系列心血管系統疾病。包括：竇房結功能障礙、房顫、室性心律失常和心功能衰竭。錨蛋白G是一種銜接蛋白，與Nav1.5有著密切聯系。類似于神經元上的Nav，在Nav DⅡ～DⅢ細胞內環中Nav1.5具有保護錨蛋白結合基序作用。而這種基序對Nav1.5的靶向性和定位到潤盤上起到非常重要的作用。減少細胞中錨蛋白G含量將減少Nav1.5在心肌細胞膜上的表達，并且單個心肌細胞總的INa密度也將減少50%～60%[13]。同樣，Nav1.5膜上的表達和總的INa密度減少主要是錨蛋白結合域上的錯義變異，這種錯義變異廢除了錨蛋白G/Nav1.5相互作用[14]。錨蛋白G能促使Nav1.5定位于心肌細胞潤盤上。一般認定的錨蛋白G鏈接基序的缺失，將導致Nav1.5與錨蛋白G發生失聯。錨蛋白G的功能缺陷將導致Nav表達、定位、功能等的障礙。同時，錨蛋白G在心臟里也是一種多功能的調節蛋白。它具有誘導βⅣ血影蛋白和鈣/鈣調素依賴蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)到心肌細胞潤盤上。以及促使CaMKⅡ調控Nav1.5的磷酸化。在錨蛋白G基因敲除老鼠實驗中發現老鼠出現明顯的房室傳導功能受損，主要表現為其心電圖上的P-R間期延長；房內傳導功能也表現出下降，主要表現為心電圖上P波持續時間延長[15]。此外，心電圖上還有QRS波的增寬[15]。同時，錨蛋白G基因敲除的老鼠也出現明顯的心臟功能改變的表現，包括：射血分數下降，心臟收縮期末和舒張期末的心腔直徑增大，心腔的前后壁增厚。βⅣ血影蛋白是一種具有結合錨蛋白G的肌動蛋白相關肽。并且在神經系統中，對錨蛋白G的正常定位βⅣ血影蛋白起著非常重要的作用。以βⅣ血影蛋白/錨蛋白為基礎的復合物對Nav1.5和細胞興奮性調節起著決定性作用。特別是βⅣ血影蛋白能與錨蛋白G、Nav1.5及CaMKⅡ在心肌細胞潤盤區域表達。而CaMKⅡ能調節Nav1.5的活動。同時，βⅣ血影蛋白具有保護C末端的氨基酸序列，這一特性在Cav1.2的β2a亞單位里類似于CaMKⅡ結合基序和CaMKⅡ自我調節域。βⅣ血影蛋白直接通過C末端基序結合CaMKⅡ，并能與錨蛋白G、Nav1.5及CaMKⅡ在體內構成一系列復合物。Nav1.5的血影蛋白基本調節主要通過位于DⅠ-DⅡ連接區域的CaMKⅡ直接磷酸化通道。

在心臟錨蛋白G可能通過胱氨酸的棕櫚?；蠼邮苤|的調控，形成了一個嚴格的結構基礎，促使信號蛋白到潤盤上，并對Nav1.5起調控作用。錨蛋白G通過βⅣ血影蛋白的誘導作用將CaMKⅡδ定位于心肌細胞潤盤上，并隨著CaMKⅡδ磷酸化Nav1.5來調控心肌細胞的興奮性。錨蛋白G相關的通路與心臟的電生理、信號通路以及結構有關，無論是否有心臟病變。Nav1.5的錨蛋白結合基序發生變異，與心肌細胞INa消失，Nav定位異常及人類的Brugada綜合征和竇房結功能障礙均有關。同時錨蛋白G基因微小的變異可能引起竇房結病變、心律失常，甚至是結構性心臟病。這些病變與心肌細胞潤盤的基本結構缺陷有關。

4 以錨蛋白G為基礎的Nav1.5通道靶向途徑與Brugada綜合征

Brugada綜合征是一種常染色體遺傳病。這種具有潛在致命性心律失常的病變在心電圖上主要以胸前區導聯(V1、V2、V3)ST段抬高伴右束支傳導阻滯和T波倒置為特點。在受此病影響的個體中，由于發生室顫常在夜間死亡。30%Brugada綜合征患者是由于SCN5A基因變異引起。SCN5A的變異引起Nav1.5的生物物理學方面特性缺陷，進而擾亂了Na離子的內流。在2002年，Brugada綜合征研究奠基者Priori和她的團隊證實了G3157A SCN5A的變異。隨后分析揭露Nav1.5 E1053K變異是位于Nav1.5 DⅡ-DⅢ的錨蛋白結合基序上。在成年大老鼠心肌細胞實驗研究中，Nav1.5 E1053K表現為潤盤和橫小管的靶向異常。因此，人類的Brugada綜合征與影響正常Nav1.5膜靶向性的SCN5A的變異有關。而錨蛋白G在Nav1.5通道的生物物理學特性上可能扮演著一種無法預料的輔助性角色。特別是在比較分析HEK293細胞時，缺失錨蛋白鏈的Nav1.5 E1053K對通道的活化、快速失活及緩慢恢復較野生型的通道展現出一種負性作用。因此，錨蛋白G對于Nav定位到心肌細胞上的細胞機制起著關鍵性作用。SCN5A的變異破壞了錨蛋白G與Nav1.5的相互作用，從而導致Nav1.5在心肌細胞上的定位出現異常。

5 錨蛋白G參與心梗后Nav的重構

在心肌梗死犬心臟的邊緣區域中，心臟Nav重構對折返型心律失常的產生提供一個關鍵因素。而Nav1.5聚集現象和功能與錨蛋白G、縫隙鏈接蛋白和機械鏈接蛋白有密切聯系。心肌梗死后Nav1.5和錨蛋白G重構發生較心肌梗死后縫隙鏈接蛋白和機械鏈接蛋白重構要晚。在心肌梗死后浦肯野纖維細胞中縫隙鏈接蛋白和機械鏈接蛋白的重構發生在冠狀動脈閉塞48 h后Nav結構和功能消失時?？p隙鏈接蛋白和機械鏈接蛋白重構出現較早可能有利于維持Nav1.5的亞單位位置和功能。

心臟組織結構中，脈沖波的形成依靠心肌細胞的興奮性和心肌細胞間電流的傳導。單個心肌細胞的興奮主要由Nav1.5所決定。分離心梗5 d后犬的心外膜區的心肌細胞表明，Nav功能的改變在心臟傳導功能減慢中起著重要的作用，并也是心梗后發生心律失常的基礎。而Nav1.5不僅與錨蛋白G有關，而且與錨蛋白G靶向于潤盤上有密切關系。研究表明，在心梗區的心肌細胞有明顯的Nav1.5蛋白結構重構現象。當Nav1.5和INa均減少時，錨蛋白G蛋白表達增加和移置到心肌梗死后殘存的有活性心肌細胞膜下區域。同時，在心肌梗死5 d后犬的梗死區心肌細胞INa的改變中發現，錨蛋白G明顯與心肌細胞的電重構有密切關系。實際上，在Nav功能和結構消失時，錨蛋白G表達是增加的。心臟Nav有明顯的儲備功能，其功能最佳的時候需通過錨蛋白G的定位和錨定。在缺血重構的急性期，錨蛋白G的含量通過鈣的活動及鈣依賴性鈣蛋白酶的作用快速地減少。因此，在心肌梗死48 h后，錨蛋白G含量的升高并穩定地調節Nav1.5蛋白募集到肌纖維膜上。

錨蛋白G涉及到Nav1.5在心肌細胞膜上特異性定位的機制，但是這種蛋白途徑的輔助性角色所起的作用機制仍然不明確。有學者認為Nav的病變主要與Nav在心肌細胞上的定位異常有關。通常遺傳性心律失常綜合征的病因很少被考慮為與心臟的離子通道和相關亞單位的生物物理學特征影響有關。在過去幾十年對錨蛋白的研究認為，作為一種膜鏈接蛋白的錨蛋白在特異性心律失常綜合征的病因中起著關鍵性作用。從而使人們對疾病的病因學方面的研究由分子結構逐步發展到細胞的組成方向。錨蛋白G調控Nav1.5定位心肌潤盤及促進膜表面的表達呈現出對心律的未來治療方法-基因靶向治療或目的蛋白合成治療法。通過調控錨蛋白的活動治療心律失常和心衰。

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