干細胞分型及其治療缺血性心肌病機制的研究進展

王紅陽，劉家袁, 梁貴友，余麗梅

(1遵義醫學院附屬醫院,貴州遵義563000；2貴州省組織損傷修復與再生醫學協同創新中心)

缺血性心肌病是指由于長期心肌缺血導致心肌局限性或彌漫性纖維化，從而產生心臟收縮和舒張功能受損，引起心臟擴大或僵硬、充血性心力衰竭、心律失常等一系列臨床表現的臨床綜合征。目前，臨床中多采用藥物、介入手術及冠脈旁路移植術等方式對患者進行治療，減緩疾病的進展，一定程度改善心臟功能，然而由于心肌細胞的缺血壞死，預后多不理想。近年來，隨著對干細胞臨床研究的深入及干細胞技術的逐漸成熟，人們發現干細胞移植可通過促進血管新生、心肌再生及旁分泌等作用改善心功能，有望成為治療缺血性心臟病的新舉措，心臟干細胞(CSCs)的再生修復等也逐漸成為新的治療靶點。由于其種類較多，因此不同的干細胞治療缺血性心肌病的作用機制也不盡相同。本文就干細胞分型及其治療缺血性心肌病的研究進展進行綜述。

1 干細胞的類型

干細胞具有自我更新和多向分化潛能，具有多種功能活性，一定條件下，可以在體內外誘導分化為心肌細胞、肝臟細胞、神經細胞、成骨細胞和脂肪細胞等多種功能細胞。根據干細胞所處的發育階段可分為胚胎干細胞和成體干細胞。根據干細胞的發育潛能可分為全能干細胞、亞全能干細胞、多能干細胞及單能干細胞，因其具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，被稱為“萬用細胞”。移植的干細胞主要包括兩大類：成體干細胞和多功能干細胞，主要包括骨骼肌成肌細胞、胚胎干細胞(ESCs)、骨髓來源干細胞(BMSCs)、羊膜干細胞及CSCs等。

1.1 骨骼肌成肌細胞 骨骼肌成肌細胞是一類位于細胞膜和肌膜之間可以分化為骨骼肌細胞的起源細胞，可在創傷后增生、重構肌肉組織。是目前臨床實驗和研究中移植應用最多的細胞之一，具有耐受缺血、缺氧環境；定向分化成具有橫紋肌特性的肌細胞；易提取、分離、培養和增殖等特點。移植后，骨骼肌成肌細胞雖不能轉分化成心肌細胞，但能與心肌細胞以合胞體的狀態結合，提高心肌的收縮力[1]。然而，Abreham等[2]研究指出移植入梗死區的骨骼肌成肌細胞只能分化成保留骨骼肌特征的心肌細胞，不能與周圍的心肌細胞形成電生理偶聯，可引起心律失常的發生。采用慢病毒轉染技術將Wnt基因轉入骨骼肌成肌細胞，結果發現轉染后的細胞中心肌早期標志物相關基因NKx2.5和連接蛋白43(Cx43)以及晚期心肌標志物相關基因α、β肌球蛋白重鏈和腦鈉尿肽mRNA表達水平升高[3]，表明轉入的Wnt基因可以促進骨骼肌成肌細胞轉分化為心肌細胞，轉基因的骨骼肌成肌細胞可能為缺血性心肌病治療的研究提供了新方向。

1.2 ESCs ESCs是從早期胚胎或原始性腺中分離出來的一類細胞，它具有體外培養無限增殖、自我更新和多向分化的特性。體內外環境中，ESCs能被誘導分化為機體所有的細胞類型。已有多項動物實驗研究表明由ESCs分化的心肌細胞具有早期心肌細胞的結構與功能，在移植入心肌梗死區域后能夠與宿主心肌細胞發生偶聯，從而一定程度地改善心臟功能[4]。然而，由于移植的ESCs可能會導致腫瘤的發生，且作為異體細胞，移植后也可能產生免疫排斥反應；導致的心律失常和胚胎獲取也頗受倫理爭議，因此，嚴重影響ESCs的臨床應用。

1.3 BMSCs BMSCs是一類存在于骨髓內具有自我復制和多向分化潛能的成體干細胞，在一定的誘導條件下，能向成骨、脂肪和成軟骨等細胞方向分化，利用其貼壁生長、采集容易、無免疫排斥、可自體移植、無倫理爭議等優點，已成為臨床研究的主要干細胞。已有研究表明，向缺血性心肌病患者的受損心肌區域移植入BMSCs能夠促進新血管生成，減輕心肌纖維化，從而改善心功能。也有報道指出粒細胞集落刺激因子(G-CSF)能夠刺激BMSCs釋放進入外周血。Kuhlmann等[5]研究發現，與單用BMSCs相比，實驗組利用G-CSF刺激BMSCs治療急性心肌梗死可以減少室性心律失常的發生，心肌梗死區域心肌上的Cx43也明顯增高，達到維持在能夠穩定心肌細胞正常傳導速度的水平。也有研究發現，G-CSF刺激動員BMSCs還有促進心肌血管再生和減緩心肌缺血再灌注損傷的作用。BMSCs注射進缺血性心肌病患者體內，患者的NYHA心功能分級、生活質量和存活率顯著增高，且缺血性心肌病患者(LVEF<50%)在經心內膜向心肌內注射BMSCs 30 d后，其心肌的梗死面積顯著減少，心功能狀態顯著改善，證明移植BMSCs治療缺血性心肌病和心功能不全不但安全，而且有效[6，7]。然而，BMSCs的作用機制目前尚未完全闡明。盡管BMSCs能否分化為心肌細胞還存在不同證據，但通過旁分泌作用，促進心肌血管生成和心肌細胞再生的作用機制日益清晰。

造血干細胞(HSCs)是來源于骨髓中具有自我更新和造血多譜系細胞分化潛能的干細胞，一般來源于骨髓、外周血和臍帶血。人的HSCs主要表達CD33、CD34、C-Kit和CD133標志分子。由于HSCs是各種血細胞的前體細胞，臨床采用HSCs移植治療人類惡性血液病已是較為成熟的技術，也是治愈白血病等重要手段。已有研究發現，將小鼠HSCs與原代心肌細胞一起培養時，發現其能表達心肌細胞膜上的內向整流鉀離子通道；從動物骨髓中分離出來的HSCs可以促進心肌血管再生和改善心功能[8]。近年的研究證明，HSCs是通過旁分泌途徑改善急性心肌梗死后的心功能和抑制心室重建的作用，促進心肌血管再生、抑制心肌細胞凋亡、聚集心臟祖細胞和改變心肌細胞外基質成分等。

內皮祖細胞 (EPCs)是血管內皮細胞的前體細胞，在生理或病理因素的刺激下，可從骨髓動員到外周血中參與損傷血管的修復。主要存在于骨髓、外周血、胎兒肝臟和臍帶血中，臨床研究及應用中多采用骨髓和臍帶血來源的EPCs。早在1997年日本學者Asahara就從外周血中分離出EPCs，證實了其可以在缺血組織和缺血器官中促進血管的生長。在創傷、局部組織缺血、血管損傷等條件刺激下，EPCs將會從骨髓和局部組織中動員，而產生新的血管。目前認為EPCs可能通過分化為血管內皮細胞和調控血管生長因子，從而促進心肌新血管再生修復受損心肌。已有研究發現通過向頑固性心絞痛患者心肌內注射EPCs治療，顯示患者的左心室功能、臨床癥狀得到了明顯改善，進而證明利用EPCs治療頑固性心絞痛是安全有效的[9]。

1.4 羊膜干細胞 羊膜干細胞來源于產婦分娩后廢棄的胎盤附屬物，羊膜來源的干細胞主要包括人羊膜上皮細胞和人羊膜間充質干細胞，具有來源廣泛、獲取方便、無創采集、細胞量豐富及無論理爭議等優點。人羊膜干細胞靜脈或原位移植后，表現出低免疫原性，無明顯排異反應和致瘤性，具有顯著的抗炎作用，還可產生多種細胞生長因子，通過旁分泌作用促進損傷或壞死細胞的再生，在心肌組織的缺血損傷中具有良好的應用前景。結扎大鼠左冠狀動脈前降支建立心肌梗死模型，1周后經心外膜移植2×106個BrdU標記的人羊膜上皮干細胞，結果發現，人羊膜上皮干細胞移植入心臟，明顯改善急性心肌梗死大鼠心臟功能，減緩心室重構，促進心肌細胞再生及新生血管形成，減輕心肌缺血的作用[10]。

1.5 CSCs 傳統觀念認為，成年哺乳動物的心肌細胞是永久性細胞，已不具有完全修復損傷再生的作用。然而，近年的研究發現剛出生的胎兒和成熟心臟都具有一定的再生修復能力，心臟中的CSCs可分化為心肌細胞、內皮細胞、平滑肌細胞，從而修復受損的心肌組織，減少心肌梗死面積。根據CSCs表面標志物結合生物學特性將其分為六類：c-kit+、Sca-1+、SP、Isl-1+、SSEA-1+及心肌球衍生細胞(CDCs)。目前c-kit+細胞是臨床研究最廣泛及最具多能干細胞特征的一類細胞，具有克隆生長、自我更新及多向分化潛能等優點。Ellison等[11]通過觀察敲除心衰小鼠CSCs后的心功能狀態，發現小鼠的心臟將會終止再生及修復功能，當重新向心肌內注射入c-kit+CSCs后，小鼠心臟的受損部位將會得到修復，表明c-kit+CSCs在受損心臟的修復過程中起著重要的作用。利用CSCs治療缺血性心肌病的Ⅰ期臨床試驗研究中，將心肌梗死后LVEF<40%的患者隨機分為實驗組和對照組，實驗組經冠狀動脈內注射自體CSCs，4個月后心臟磁共振成像檢測顯示，實驗組心肌的梗死面積顯著減少，MLHFQ評分明顯增高[12]。經冠脈內注射CDCs后能夠治療患者的缺血性心肌病癥狀，實驗將心肌梗死后2～4周的心衰患者(25%≤LVEF≤45%)隨機分為實驗組和對照組。實驗組將自體CDCs輸入心肌梗死區域， 6個月和12個月后，與對照組相比實驗組的心肌梗死面積顯著減少，心肌存活率和收縮力都顯著增強，且無不良反應發生。由此說明，采用經冠脈內注射CDCs進行治療缺血性心肌病的方法安全有效[13]。此外，近幾年的研究表明干細胞來源的外泌體在干細胞發揮旁分泌作用[14]，外泌體可以通過抑制心肌細胞凋亡來減少心肌梗死面積；也可作用于內皮細胞，促進血管內皮細胞增生和轉移；作用于中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞，減緩心肌的炎癥反應和氧化應激損傷，刺激CDCs分化為心肌細胞，從而改善缺血性心肌病患者的心功能。

2 干細胞治療缺血性心臟病的作用機制

2.1 直接分化為功能細胞 研究發現，因干細胞具有多向分化潛能，在一定的誘導條件下可以分化為心肌細胞、內皮細胞及平滑肌細胞。在體內外實驗研究中，均可以誘導BMSCs向心肌細胞分化，將BMSCs移植入心肌梗死區域后，它能表達心肌細胞表面標志物如肌鈣蛋白T、α-肌動蛋白和連接蛋白等，也可表達平滑肌細胞和血管內皮細胞表面的特異性蛋白[15]，說明移植后的BMSCs分化為心肌細胞和血管內皮細胞后，既可減少心肌梗死面積，也可促進心肌再生和血管再生，從而顯著改善缺血心肌的心臟功能。

2.2 促進血管再生 諸多研究表明，干細胞用于缺血性心肌病的治療，能夠促進心肌血管的生成，改善心肌的血供，減少心肌細胞的壞死，進而改善心功能。BMSCs能夠促進血管內皮細胞有絲分裂、增生和遷移，從而實現心肌局部缺血組織的血管再生，進而改善心臟的功能。ESCs在缺氧條件下也能夠分泌外泌體，從而促進胚胎中的微血管內皮細胞遷移及血管化。向心肌梗死小鼠的心肌內注射BMSCs來源的微泡能夠顯著改善梗死心肌的血流狀況，促進血管內皮細胞的增生和遷移，促進心肌內微血管增生，抑制梗死區域心肌細胞凋亡，從而顯著改善心肌的功能[16]，外周血、脾臟、脂肪等其他來源的干細胞研究中，也發現在促進血管再生過程中存在著相似的機制和效果。

2.3 旁分泌作用 干細胞旁分泌效應對心肌細胞的保護作用日益受到重視，外泌體作為干細胞旁分泌效應的代表性物質，已被作為一種新型替代療法應用于治療心血管疾病中。不同干細胞來源的外泌體可通過促進受體細胞存活、增殖、新生血管形成、改善心肌內側支循環、改善心肌代謝、抑制心肌細胞凋亡、抑制心肌纖維化、改善心肌重構等多種方式，促進梗死心肌再生修復，提高心臟功能。在心肌的再灌注治療中，可以明顯減輕心肌的炎癥反應及氧化應激損傷，從而抑制心肌細胞凋亡，減少心肌的梗死面積。MSCs還可通過產生一些造血細胞因子來發揮其生物學效應，如血管內皮生長因子、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1、干細胞因子等。

2.4 免疫調節作用 間充質干細胞具有低免疫原性及免疫調節的作用，能夠逃避免疫識別和抑制免疫應答,還能夠通過對抗原提呈細胞、T細胞、NK細胞、B細胞等免疫細胞的影響而發揮免疫調節作用。已有研究發現，BMSCs誘導的免疫抑制反應不是直接的細胞效應，而是由調節免疫細胞釋放到炎癥微環境中的多種炎性細胞因子和抗炎因子介導，如INF-γ、TNF-α及IL-1α和β、IL-4、IL-10等。缺血性心肌病患者移植BMSCs后，心肌梗死面積顯著減少，心臟功能不但有所改善，心肌組織中的炎癥因子TNF-α、IL-1β等也顯著減少。

盡管多個國家在積極開展干細胞治療缺血性心肌病的臨床研究與轉化應用，目前也尚未觀察到間充質干細胞移植后引起的嚴重不良反應，但仍缺乏大規模臨床研究，其遠期療效與安全性尚無法預知。隨著干細胞活體示蹤、心肌存活與功能檢測及評估新技術的誕生，干細胞移植治療心肌梗死及心功能不全等疾病的臨床應用也將會得到更大發展。選擇適宜的干細胞類型，探索其在臨床應用中的有效性和安全性，有望提高缺血性心肌病的治療效果。

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