從補陽還五湯治療腦卒中談中藥復方藥理學新模式及發(fā)展方向＊

沈劍剛

（香港大學中醫(yī)藥學院 香港）

腦卒中為人類疾病的第二大死亡疾病，在中國為第一大死亡原因。我國腦卒中發(fā)病率以每年8.7%的速度上升，其中缺血性卒中占80%[1]。腦卒中分為出血型和缺血型兩種，由于治療策略完全不一樣，早期診斷和治療非常重要。腦成像技術飛速發(fā)展為腦卒中診斷提供了有用的工具。搶救“半暗區(qū)”是拯救卒中存活腦細胞的關鍵治療策略。1996年美國FDA批準的t-PA是有效治療急性缺血性腦卒中的藥物，但是它有一個非常狹隘的4.5 h時間窗，超過4.5 h有出血的危險和增加卒中死亡率[2,3]。另外，神經(jīng)保護和神經(jīng)康復藥物的研發(fā)并不理想。動物實驗中有效的神經(jīng)保護藥在臨床觀察卻無效。

卒中是一個多靶點多系統(tǒng)參與的病理過程，特定單靶點藥物的發(fā)展策略具有較大的局限性是其中重要原因，缺血性腦損傷修復過程不是單一分子參與，而是網(wǎng)絡調控的結果。用幾個單靶點治療藥物，或幾個藥物的聯(lián)合用藥是無法解決實際問題的。因為缺乏有效且安全的藥物治療方法，不少卒中患者遺留終身癱瘓。神經(jīng)醫(yī)學對卒中的治療重點亦逐漸從卒中神經(jīng)保護轉入到神經(jīng)再生。

1 腦卒中干細胞治療現(xiàn)狀及中醫(yī)藥的機遇與挑戰(zhàn)

近年來，干細胞生物學取得重大進展，外源性神經(jīng)干細胞移植及靶向性內源性神經(jīng)干細胞增殖分化已經(jīng)成為腦卒中治療新方向。但是外源性神經(jīng)干細胞移植費用昂貴，供體細胞來源及細胞移植后的免疫排異反應等問題，造成此技術目前在臨床應用上存在一定的局限性，干細胞治療用于臨床還有很長一段時間。腦卒中后內源性神經(jīng)再生是目前重要研究方向和治療靶點，成年哺乳動物的大腦內只有嗅球，側腦室管膜下區(qū)（Subventricular Zone，SVZ）和海馬齒回的顆粒下區(qū)（Subgranular Zone，SGZ）等少數(shù)區(qū)域能發(fā)生神經(jīng)再生[4,5]。研究表明，新生的神經(jīng)元之間的連結能改善運動能力及學習記憶能力[6-8]。缺血缺氧能夠刺激釋放活性物質喚醒沉睡的干細胞，促進神經(jīng)干細胞生長和神經(jīng)再生，達到內源性神經(jīng)修復。這種現(xiàn)象不僅在動物模型而且在腦卒中病人得到證實[9-11]。暴露于1-5%的O2下可以促進神經(jīng)干細胞向多巴胺能神經(jīng)元發(fā)展[12]。但是這種自發(fā)的神經(jīng)干細胞的生長和腦修復過程并不能真正有效的恢復腦卒中后缺損的神經(jīng)功能,從而造成病人終身癱瘓。如何刺激內源性的神經(jīng)干細胞分化成為功能性神經(jīng)元，使它們遷移到缺血的區(qū)域替代、修復損傷區(qū)域是一個重大研究課題。目前已有研究從非編碼核糖核酸[13]、血清素[14]、趨化因子[15]等不同角度探討腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)再生的治療策略。故針對內源性神經(jīng)干細胞增殖分化的策略可能是新藥研究的重要方向。由于干細胞修復過程中大量信號分子參與腦修復過程，發(fā)展多種藥物聯(lián)合治療多靶點調控是關鍵，但是，實際操作調控多少成分以及調控多大程度非常困難。

中醫(yī)藥以其多成分、多靶點治療體系在中風治療上有獨特優(yōu)勢，腦卒中屬于中醫(yī)藥學“中風”病范疇，中醫(yī)藥積累了臨床行之有效的方劑，用于治療中風病證及中風后遺癥病人。從現(xiàn)代藥理學藥代動力學角度而言，中草藥是多成分多靶點治療體系，不像西藥純化合物的血藥濃度在12 h內達到峰值，每一個個體藥物是相對低的血藥濃度慢慢累積，經(jīng)過長時間治療以后，給自身調控留有了空間，這在邏輯角度講，是一個非常合理的思路。這就引出了幾個問題：如何尋找證據(jù)證明？是否有特異性的靶點？另一方面，由于其成分的多樣性、作用靶點的復雜性、品質控制的困難性和缺乏系統(tǒng)的循證醫(yī)學的研究，中醫(yī)藥在治療中風方面的國際認受性受到挑戰(zhàn)。

我們長期致力于中風后氧化損傷修復的藥物開發(fā)及神經(jīng)再生研究。我們曾經(jīng)對中醫(yī)經(jīng)典復方補陽還五湯從基礎到臨進行了系列研究，現(xiàn)以補陽還五湯的神經(jīng)保護和促進腦修復為例談談中醫(yī)藥治療中風及其后遺癥的啟示。

2 補陽還五湯治療腦卒中經(jīng)典認識與臨床研究現(xiàn)狀

腦卒中在中醫(yī)藥學中屬于中風病范疇。《黃帝內經(jīng)》認為中風病的發(fā)生與“正氣不足，外受風邪”有關，其中《靈樞?刺節(jié)真邪》篇記載“虛邪偏客于身半，其入深，內居營衛(wèi)，營衛(wèi)稍衰，則真氣去，邪氣獨留，發(fā)為偏枯”。《金匱要略》認為中風主要病因為絡脈空虛，風邪入中。金元時期李東垣認為中風非外來風邪，乃正氣自虛所致,明代張景岳指出中風為內傷積損所致,至清代王清任提出中風是由真陰虧損，元氣虛脫所致。補陽還五湯是清代醫(yī)學家王清任《醫(yī)林改錯》治療“因虛致瘀”中風病證的傳統(tǒng)中醫(yī)名方，為補氣行瘀、疏通經(jīng)絡的代表方劑。用“黃芪四兩（生）、歸尾二錢、赤芍錢半、地龍一錢（去土）、川芎一錢、桃仁一錢、紅花一錢”。用于“因虛致瘀”的中風病證[16]。重用黃芪四兩為君藥,補益元氣，去瘀通絡。當歸尾為臣藥，活血通絡。赤芍、川芎、桃仁、紅花為佐藥，協(xié)同當歸尾以活血祛瘀；地龍通經(jīng)活絡，周行全身，以行藥力。《醫(yī)林改錯》提出：“此方治半身不遂、口眼歪斜、語言蹇澀、口角流涎、大便干燥、小便頻數(shù)、遺尿不禁。”本方以氣虛為本，血瘀為標，所以，補陽還五湯之立意為“瘀血不去，新血不生”和“不破不立，瘀祛新生”[17,18]。

近年來，開展了大量補陽還五湯治療中風病證及中風后遺癥臨床試驗[19]，評價補陽還五湯治療腦卒中及其后遺癥的療效，我們曾經(jīng)就補陽還五湯治療急性缺血性中風的療效及其安全性作過系統(tǒng)評價[19]。從各種數(shù)據(jù)庫1995-2012年期間記錄的354個臨床研究報道和觀察中，尋找到354個國內外文獻報道補陽還五湯治療中風臨床治療有效，按照循證醫(yī)學標準，最后納入符合標準的19個臨床療效評價，在分析過程中又剔除了1個，最后18個臨床試驗進入了Meta分析體系。系統(tǒng)性評價納入1580個病例，對補陽還五湯結合常規(guī)西醫(yī)方法與單純西醫(yī)治療方法作比較,中風治療的金標準為治殘率和治死率，但是，很遺憾所有的試驗中沒有提及治殘率和治死率。而且臨床療效評價存在出版偏見。Meta分析顯示，補陽還五湯的確有改善神經(jīng)功能障礙的作用，未見明顯副作用。但是，臨床試驗在嚴格循證醫(yī)學標準意義上還有許多缺陷，其臨床療效有待進一步確認。目前臨床研究存在的主要問題包括：缺乏終點事件的評價：只有1個研究觀察了Barthel指數(shù)以評價補陽還五湯對致殘率的作用，兩組之間致殘率無顯著性差異（Peto OR,0.36.95%C1,0.12 to 1.07）[20]，未見有對死亡率的評價結果；研究同質型較差：補陽還五湯促進神經(jīng)功能修復臨床試驗的異質性使結論審慎樂觀；出版偏差，funnel plot分析顯示了出版偏差可能影響有關結論。詳細的系統(tǒng)性評價可以參考研究報告[19]。為確證中醫(yī)藥臨床療效，我們應當設計嚴格的臨床試驗。但是應當指出，補陽還五湯是氣虛血瘀型中風治療方劑，對于其他證型的中風病人不一定適當，目前的臨床研究極少考慮這方面的問題，從而為臨床療效結論帶來不確定性，如何對中醫(yī)藥治療中風療效進行科學和客觀的評價值得深入研究。雖然如此，通過Meta分析，我們證明補陽還五湯臨床治療中風改善神經(jīng)功能有效。

3 補陽還五湯治療腦卒中神經(jīng)保護和促進腦修復實驗研究現(xiàn)狀

我們早期研究顯示，補陽還五湯含藥血清抑制體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元p53和p21基因表達，減少缺氧神經(jīng)元凋亡[21,22]。補陽還五湯調節(jié)大鼠腦缺血后一氧化氮合酶活性，減少氧化損傷，保護缺血后腦組織[23]。補陽還五湯及不同配伍組方促進缺血性腦中風后大鼠神經(jīng)增殖[24]。補陽還五湯能改善顯著線栓大鼠大腦中動脈阻塞模型神經(jīng)功能障礙癥狀，減少中性粒細胞浸潤和ICAM-1表達，增加缺血皮層周邊區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)[25]。下調腦缺血模型大鼠TNF-α、IL-6、C反應蛋白(CRP)水平[26]，降低線栓法大腦中動脈阻斷（MCAO）大鼠模型血清及腦組織IL-6、NF-κB等炎癥因子水平[27]，改善腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)陽性神經(jīng)元細胞的損傷，降低腦卒中指數(shù)評分，增加海馬內5-HT的含量[28]，減少腦組織梗死面積，下調血清中CD63、CD62P因子表達[29]。進而減少血管內皮細胞的炎性免疫反應。我們研究發(fā)現(xiàn)NO/caveolin-1/MMP-9信號通路是腦缺血再灌注損傷過程中血腦屏障破壞的重要治療靶點[30]。Caveolin-1也是神經(jīng)炎癥損傷中淋巴細胞通過血腦屏障的重要靶分子[31]。補陽還五湯組顯著提高caveolin-1,-2的表達，在3，7天時模型組與補陽還五湯組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01)[32]。說明補陽還五湯能夠保護腦缺血再灌注損傷過程中血腦屏障的完整性。以上實驗證據(jù)提示補陽還五湯的神經(jīng)保護機制與抗炎癥因子、抗氧化、調節(jié)細胞信號及凋亡相關基因有密切關系。

我們早期研究顯示，補陽還五湯能促進大鼠腦皮層神經(jīng)元生長[33]。含補陽還五湯血清藥物成份促進常規(guī)培養(yǎng)及缺氧神經(jīng)元生長作用[33]。補陽還五湯含藥血清對體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞缺氧性損傷具有明顯保護作用，可促進缺氧環(huán)境下神經(jīng)干細胞的增殖和分化，還可促使低糖低氧損傷的神經(jīng)干細胞遷出數(shù)量增多，遷移距離增加[34]。我們觀察了大鼠缺血性腦卒后遺癥模型補陽還五湯促進神經(jīng)元增殖作用。補陽還五湯水煎液增加了缺血性腦卒后遺癥大鼠腦組織中5-溴脫氧核苷尿嘧啶（BrdU）的表達，顯示具有促進神經(jīng)增殖作用[35]。補陽還五湯能促進血管內皮生長因子（VEGF）和其受體Flk1的表達，刺激神經(jīng)干細胞增殖，減少梗塞面積和促進神經(jīng)功能的修復[35]。補陽還五湯促進神經(jīng)干細胞的增殖、分化及遷移，改善實驗性腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損作用[36]。最近研究顯示，補陽還五湯通過促進神經(jīng)再生和神經(jīng)保護機制而減輕腦卒中后抑郁癥的發(fā)生[37]。

補陽還五湯促進中風后腦修復和重建神經(jīng)功能信號通路和相關機制也有很好的進展。補陽還五湯可上調缺血腦組織中神經(jīng)生長因子、神經(jīng)膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，增加生長相關蛋白GAP-43和PSD-95的表達，促進腦缺血后大鼠神經(jīng)元突觸重塑[38]。加減補陽還五湯增加腦缺血后神經(jīng)元內腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)生長因子的含量[39]。含補陽還五湯血清可以促進神經(jīng)突生長，并明顯降低細胞內鈣離子濃度[40]。補陽還五湯升高細胞外信號調節(jié)激酶E表達，促進缺血區(qū)域神經(jīng)元的生長和分化[41]。補陽還五湯補氣藥和活血藥能協(xié)同促進腦缺血后神經(jīng)發(fā)生和恢復神經(jīng)功能，可能是通過改善局部神經(jīng)生長微環(huán)境，促進表達神經(jīng)再生中神經(jīng)營養(yǎng)因子（NTFs），誘導神經(jīng)干細胞的增殖、遷移及定向分化，進而降低神經(jīng)抑制因子的表達，減輕繼發(fā)性損傷[42]。因此，補陽還五湯能調節(jié)多種細胞信號通路，促進內源性神經(jīng)干細胞增殖、分化、遷移和新生神經(jīng)元整合到反射環(huán)路以修復神經(jīng)功能，達到中風后腦修復和重建神經(jīng)功能的效果。有關其對多種細胞信號通路的調節(jié)作用已得到蛋白質組學研究證實[43,44]。補陽還五湯的有效成分包括：Ferulic acid，calycosin，formononetin，astrapterocarpan-3-O-β-D-glucoside，paeonol，calycosin-7-O-β-D-glucoside，astraisofla-van-7-O-β-D-glucoside，ligustrazine和propyl gallate能夠抑制 concanavalin A(Con A)所致淋巴細胞增殖；Propyl gallate，calycosin-7-O-β-D-glucoside，paeonol和ferulic acid抑制脂多糖所致淋巴細胞凋亡；Propyl gallate and formononetin抑制脂多糖所致淋巴細胞釋放一氧化氮；Hydroxysafflor yellow A和inosine保護谷胺酰胺所致PC12細胞損傷Formononetin,astragaloside IV，astraisoflavan-7-O-α-D-glucoside，inosine，paeoniflorin，ononin，paeonol，propyl gallate，ligustrazine和ferulic acid抑制氯化鉀引起的胸主動脈收縮；說明補陽還五湯通過多種成分作用于多種途徑起到保護缺血腦組織的作用[43]。另有研究運用蛋白質組學分析了小鼠腦組織1310條基因，結果顯示，對腦組織877條基因定量分析發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注造10.26%（90/877）基因發(fā)生改變，t-PA溶栓治療組減少到2.62%（23/877）基因發(fā)生改變，而補陽還五湯治療組只有1.71%（15/877）基因發(fā)生改變，功能分析發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯能調節(jié)血腦屏障完整性（Alb，F(xiàn)ga，and Trf），抑制興奮性毒性（Grm5，Gnai and Gdi），增強能量代謝（Bdh），抑制glycogen synthase kinase 3（GSK-3）和Tau蛋白和促進神經(jīng)再生能力[44]。生物信息學研究顯示，補陽還五湯所含411個成分中所對應調節(jié)的82個靶分子中，分子對接計算顯示，超過80%的分子和靶點有很好的直接作用親和性[45]。因此，補陽還五湯通過調節(jié)多信號通路保護神經(jīng)細胞和促神經(jīng)再生。此外，補陽還五湯還可以使大鼠腦缺血后7-14天血管生成基因如血管內皮生長因子（VEGF）和其受體Flk1的表達上調[46]。

4 總結與啟示

綜上研究，補陽還五湯既可以保護神經(jīng)細胞，又可以促進神經(jīng)干細胞腦修復。還有調控血管新生靶點信號，促進腦缺血后血管新生的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)進一步支持這個觀點。這不是單點調控，而是系統(tǒng)調控，發(fā)揮其保護神經(jīng)細胞促進腦修復作用。不同的有效成分作用不同的靶點,在復方治療體系中,可能存在與單一化學藥物不同的藥理學模式。比如，這種多成分復方治療體系的量效關系，可能是不同于單一化合物，它可能存在一種接力賽的關系，相互之間存在協(xié)調效應。對于中藥活性復方將是未來中醫(yī)藥發(fā)展的方向。什么是活性復方？活性復方必須符合2個要素：在中醫(yī)理論指導下的有大量臨床研究證據(jù)說明其有效性的中藥復方；在質量控制上達到現(xiàn)代藥物標準，活性成分相對清楚，作用靶點明確的中藥復方。嚴格而言，要達到這個標準是不容易的。用多學科技術和方法研究中藥復方，不僅為闡明中藥復方的治療原理提供希望，而且為中風新藥研究奠定基礎。

隨著中醫(yī)藥全球化和廣泛傳播，中醫(yī)藥對許多疾病的療效受到西方主流醫(yī)學界關注，在中醫(yī)師報道的一些西醫(yī)認為沒有辦法治療的臨床病例中,用中醫(yī)藥治療完全治愈。但是國際主流醫(yī)學雜志的有關臨床研究報告的結論卻多數(shù)顯示無效，令人感到很困惑。這可能是中西醫(yī)研究方法學上不同而產(chǎn)生的問題。中醫(yī)藥臨床研究存在自身的內在規(guī)律。中醫(yī)藥是一個動態(tài)治療體系，不是固定一個方對某種疾病單一的調節(jié)，這就很難用傳統(tǒng)的統(tǒng)計學方法進行分析。因此如何發(fā)展有效方法去理解這樣一個復雜治療體系，對于今后中醫(yī)藥的發(fā)展至關重要。隨著新的化學分析技術和各種組學技術和人工智能發(fā)展和運用于中醫(yī)中藥的研究，我們將有機會打開中醫(yī)復方治療疾病的寶庫，使中醫(yī)中藥更好的用于人類健康和疾病治療。