85例腎移植術后受者CYP2D6基因多態性及他克莫司血藥濃度/劑量觀察

劉克鋒，許海江，曹雨晴，劉宇，趙杰

(鄭州大學第一附屬醫院，鄭州450052)

他克莫司(FK506)是一種從土壤微生物肉湯培養基中分離提純得到的大環內酯類免疫抑制劑，屬于鈣調磷酸酶抑制劑[1,2]，治療器官移植術后產生的免疫排斥具有顯著療效。由于他克莫司治療窗狹窄，個體間藥代動力學差異大，故需要進行血藥濃度監測[3,4]。CYP2D6是一種重要的P450系氧化代謝酶，參與多種藥物的代謝過程，其基因多態性對藥物的代謝有明顯影響[5～7]，CYP2D6基因單核苷酸多態性有可能影響他克莫司在體內的代謝。本研究觀察了漢族腎移植受者CYP2D6基因1065852位點和16947位點多態性，以及上述多態性與他克莫司血藥濃度/劑量(C/D)的相關性，探討通過檢測CYP2D6基因型指導腎移植術后受者他克莫司用量的可行性。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇 2013年8月～2016年10月在我院進行腎移植手術的患者85例。納入標準：首次進行腎移植手術，依從性好，均口服他克莫司+嗎替麥考酚酯膠囊+醋酸潑尼松三聯免疫抑制方案，均不使用利福平、紅霉素等顯著影響他克莫司血藥濃度的藥物。排除術后1個月內出現嚴重排斥反應或并發嚴重感染的腎移植患者。入組患者男62例、女23例，年齡(34.94±10.98)歲，身高(167.22±9.37)cm，體質量(59.12±13.63)kg。本研究已獲醫院醫學倫理委員會批準，入組患者均簽署知情同意書。

1.2 CYP2D6基因rs1065852位點和rs16947位點多態性檢測 采集腎移植患者外周靜脈血2～3 mL，按照血液基因組柱式小量提取試劑盒說明書提取患者DNA于-20 ℃保存。采用Sequenom MassArray系統基因分型方法對患者進行CYP2D6基因rs1065852位點和rs16947位點多態性檢測，所需引物均用AssayDesigner 3.1軟件進行引物設計。rs1065852位點上游引物5′-ACGTTGGATGAGTCCACATGCAGCAGGTTG-3′-，下游引物5′-ACGTTGGATGTGGTGGACCTGATGCACCG-3′，退火溫度53.3 ℃；rs16947位點上游引物5′-ACGTTGGATGTGAGAGCAGCTTCAATGATG-3′，下游引物5′-ACGTTGGATGTGGTCGAGGTGGTCACCATC-3′，退火溫度46.6 ℃。PCR反應體系共5 μL ，含有雙蒸水1.8 μL、10×PCR緩沖液0.5 μL、25 nmol/L氯化鎂溶液0.4 μL、25 mmol/L dNTP混合液0.1 μL、0.5 μmol/L引物混合液1 μL、5 U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，10 ng/μL的DNA 1 μL。反應過程為94 ℃預變性15 min,94 ℃變性20 s，分別在53.3 ℃、46.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環45次，72 ℃最后延伸3 min。

1.3 他克莫司應用方法及C/D測算 患者術后第2天開始服用他克莫司，2次/d，劑量為0.15～0.30 mg/(kg·d)，根據他克莫司血藥濃度及患者臨床表型及時調整劑量，待他克莫司血藥濃度穩定后，于患者晨起服藥前取靜脈血2～3 mL放置在EDTA-K2真空管中，用酶聯免疫吸附法在全自動免疫分析儀上測定他克莫司血藥濃度。他克莫司C/D=他克莫司血藥濃度/他克莫司劑量。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。采用HWE檢驗基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。多個基因型患者他克莫司C/D比較采用Kruskai-Wallis秩和檢驗，兩個基因型患者他克莫司C/D比較采用Mann-Whiteny秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CYP2D6基因rs1065852位點和rs16947位點多態性分布 85例患者中CYP2D6基因rs1065852位點基因型為GG者27例、GA者39例、AA者16例，等位基因G、A頻數分別為93(56.71%)、71(43.29%)；rs16947位點基因型為GG者47例、GA者27例、AA者11例，等位基因G、A頻數分別為121(71.17%)、49%(28.82%)。上述2個單核苷酸多態性位點的基因分布符合Hardy-weinberg平衡(P>0.05)，表明本研究樣本具有良好的代表性。

2.2 不同基因型者他克莫司C/D比較 CYP2D6基因rs1065852位點基因型GG、GA和AA型患者他克莫司C/D值分別為104.48±57.83、143.46±77.49、124.74±80.17，GG型和GA型患者他克莫司C/D值相比，P<0.05。CYP2D6基因rs16947位點基因型GG、GA和AA型患者他克莫司C/D值分別為159.10±121.21、128.49±81.68、108.84±70.19，P>0.05。

3 討論

他克莫司是從土壤真菌的肉湯培養基中提取的大環內酯類抗生素，是一種強效免疫抑制劑[8,9]，廣泛應用于器官移植術后排斥反應的預防和治療。但是由于他克莫司治療窗窄，個體差異大，故需要進行血藥濃度監測。國內外大量研究[10～12]表明CYP3A代謝酶和藥物轉運體P-糖蛋白與他克莫司血藥濃度有相關性，但是關于CYP2D6代謝酶對他克莫司血藥濃度影響的研究較少。雖然CYP2D6代謝酶在肝臟中的含量只占肝臟總量的2%，但是卻參與了25%以上的藥物的代謝活動，并且CYP2D6是細胞色素P450基因家族中惟一不能被誘導的酶，而該酶的基因多態性對酶的代謝和功能有重要影響[9]。故本研究探討了CYP2D6基因單核苷酸多態性對腎移植術后患者他克莫司C/D的影響。

目前國內關于CYP2D6基因多態性對腎移植術后患者他克莫司代謝影響的研究僅有兩篇文獻報道。周逸雯等[10]認為CYP2D6基因多態性與他克莫司代謝并無明顯的相關性，而Pokhrel等[11]研究結果顯示CYP2D6基因單核苷酸多態性與他克莫司代謝相關，野生型和突變雜合子與突變純合子相比較，需要更高劑量的他克莫司才能達到相同的抗排斥效果。本研究中rs1065852位點基因型為GG型者有27例、GA型者39例、AA型者16例，GA型與GG型患者他克莫司C/D有顯著性差異，若要達到相同的他克莫司血藥濃度，GG型腎移植患者需要更高的劑量。rs16947位點基因型為GG型者47例、GA型者27例、AA型者11例，3型患者他克莫司C/D無顯著性差異，也就是說rs16947位點單核苷酸多態性對腎移植術后患者他克莫司血藥濃度并沒有影響。

綜上所述，盡管CYP2D6基因rs1065852位點單核苷酸多態性與腎移植術后受者他克莫司C/D有一定相關性，但是仍然需要綜合考慮多種因素的影響。研究CYP2D6基因多態性與腎移植術后受者他克莫司C/D的關系還需要長期和大樣本量的研究。無論如何，腎移植受者服用他克莫司前檢測CYP2D6基因rs1065852位點多態性都有助于個體化給藥，提高臨床療效和減少不良反應的發生。

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