多發性骨髓瘤患者外周血循環DNA水平變化及其意義

劉憲凱，吳隼，呂國慶，楊滿，張媛，王艷閣，陶貞，任毅飛

(新鄉醫學院第一附屬醫院，河南衛輝 453100)

循環DNA(cf-DNA )指的是存在于血液、腦脊液、尿液等體液并游離于細胞外的DNA。腫瘤患者血液游離DNA水平明顯升高[1]。隨著近年來DNA提取、檢測、測序等分子生物學技術的迅猛發展，cf-DNA與各種疾病之間的關系逐漸被揭示出來，cf-DNA在乳腺癌[2]、卵巢癌[3]等腫瘤篩查、診斷、療效預測、預后評估、復發診斷等方面顯現出重要的臨床價值，但是多發性骨髓瘤(MM)患者外周血cf-DNA水平的變化及其臨床意義尚不明確。本研究觀察了初治、復發MM患者外周血cf-DNA水平的變化，并探討初治MM患者外周血cf-DNA水平與患者年齡、性別、ISS分期、髓外浸潤、白細胞計數、血沉、血清乳酸脫氫酶水平的關系以及化療后外周血cf-DNA水平與化療效果的關系，旨在明確外周血cf-DNA水平在MM診斷、病情判斷、化療效果預測中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年3月～2017年8月新鄉醫學院第一附屬醫院血液科收治的21例初治MM患者為MM組，其中男12例、女9例，年齡48～68歲，中位年齡53.7歲。ISS分期Ⅰ期11例、Ⅱ期7例、Ⅲ期3例。有髓外浸潤11例、無髓外浸潤10例。MM的診斷標準參照2015年中國MM診治指南[4]。排除標準[5]：不能配合研究者，并發結締組織病者。另選20例健康體檢者對照組，其中男11例,女9例；年齡36～67歲，中位年齡51.1歲。三組患者性別、年齡相比，P均>0.05。本研究已獲醫院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 外周血cf-DNA檢測 初治組MM患者每周期化療前留取外周血3 mL，復發組患者入院時抽取外周血3 mL，對照組體檢時采集外周血3 mL，將標本分別注入EDTA抗凝管中，3 h后按cf-DNA提取試劑盒說明書操作提取外周血cf-DNA，-20 ℃保存備用。采用熒光定量PCR法檢測cf-DNA水平。cf-DNA上游引物5′-AGCCGTGTTCTTTGCACTTT-3′，下游引物5′-CAGAGGCGTACAGGGATAGC-3′。按Tap MasterMix說明書操作進行擴增。讀取樣品的吸光度值。以人類基因組DNA為標準品，10倍連續梯度稀釋，以標準品的濃度和吸光度的讀數值繪制標準曲線，根據標準曲線和樣品的吸光度值計算樣品cf-DNA水平。

1.3 初治組化療及結果判定方法 均采用VAD方案化療。化療3療程后采用國際骨髓瘤工作組(IM-WG) 的標準的評價療效[6],分為完全緩解(CR)、非常好的部分緩解(VGPR)、部分緩解(PR) 、輕微反應(MR)、疾病穩定(SD)和疾病進展(PD)。其中CR+VGPR為預后良好，PR+MR+SD+PD為預后不良。

2 結果

2.1 兩組外周血cf-DNA水平比較 MM組、對照組外周血cf-DNA水平分別為(177.59±40.31)、(14.77±3.12)ng/mL。兩組患者外周血cf-DNA水平相比，P<0.05。

2.2 MM組患者外周血cf-DNA與性別、年齡、ISS分期、髓外浸潤、白細胞計數、血沉、血清乳酸脫氫酶水平的關系 初治組男、女性患者外周血cf-DNA分別為(187.59±40.31)、(176.59±40.31)ng/mL，P>0.05。有、無髓外浸潤患者外周血cf-DNA分別為(223.59±40.31)、(143.59±40.31)ng/mL，P<0.05。ISS分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者外周血cf-DNA分別為(108.23±20.31)、(164.29±33.51)、(207.15±47.82)ng/mL，MM患者外周血cf-DNA水平隨ISS分期升高而升高(P<0.05)。經Spearman相關性分析結果顯示，MM組患者外周血cf-DNA水平與患者白細胞計數(r=0．318)、血沉(r=0.628)、乳酸脫氫酶(r=0.916)均呈正相關(P均<0.05)，與年齡無相關性(P>0.05)。

2.3 MM組患者化療效果及不同化療效果患者化后外周血cf-DNA水平比較 MM組患者采用VAD方案化療3周期后預后良好8例、預后不良13例。預后良好、預后不良患者化療后外周血cf-DNA水平分別為(79.36±19.30)、(183.73±49.22)ng/mL，預后良好、預后不良患者化療后外周血cf-DNA水平相比，P<0.05。

3 討論

cf-DNA亦稱游離DNA, 源自于釋放到血液、腦脊液、滑膜液、尿液等體液中的降解DNA片段，來自于壞死、凋亡的細胞[6，7]。近年來cf-DNA在腫瘤診治中的應用逐步成為臨床研究的焦點，cf-DNA在腫瘤的早期診斷、病情評估、藥物反應監測、復發轉移及預后的預測等方面均有著重要的應用價值[2，8～10]，但以往研究多針對實體腫瘤，在惡性血液系統疾病中的相關研究少見。

隨著基于 PCR 技術的迅速發展及廣泛應用，應用于早期研究中的放射免疫分析、酶聯免疫吸附試驗、斑點雜交等方法已經逐漸被 PCR 所取代。本研究采用實時熒光定量PCR法定量檢測外周血cf-DNA水平，結果顯示健康體檢者外周血cf-DNA水平均值為14.77 ng/mL。文獻報道健康人外周血cf-DNA平均水平約為30.0 ng/mL，與本研究結果不盡相同，考慮與標本采集流程、檢測方法、試驗器材精準度等缺乏統一標準相關，因此各實驗室之間的結果可比性差，但本實驗各標本基于同一平臺檢測，各組之間存在可比性。多項研究[1，12，13]表明，腫瘤患者與健康個體相比有較高的外周血cf-DNA水平,這些升高的cfDNA主要來自癌細胞。本研究結果顯示MM組患者外周血cf-DNA水平高于對照組。相關性分析提示MM組外周血cf-DNA水平與白細胞計數呈正相關性，，進一步證實外周血cf-DNA水平來源于腫瘤細胞，并提示檢測外周血cf-DNA水平有助于診斷MM。

Olsson 等[14]報道外周血cf-DNA水平與乳腺癌患者預后呈正相關性，ISS分期可以反映MM患者的預后情況，本研究結果顯示ISS分期越高，外周血cf-DNA水平越高。髓外浸潤、血沉、乳酸脫氫酶等指標與MM患者預后相關。本研究結果顯示MM患者外周血cf-DNA水平與髓外浸潤、血沉、血清乳酸脫氫酶水平有關，提示外周血cf-DNA水平可以作為評判MM患者病情和預測預后的指標。

本研究顯示外周血cf-DNA可以反映MM患者腫瘤負荷，隨著規律化療方案的進行，MM患者腫瘤負荷逐步減少，因此理論上外周血cf-DNA亦呈下降趨勢，研究中動態監測初治組患者外周血cf-DNA水平的變化，不同緩解程度患者化療前外周血cf-DNA含量無明顯差異，而化療前后外周血cf-DNA水平的下降程度與緩解深度呈正相關性，有研究[15]顯示在淋巴瘤中同樣存在這種現象，有可能通過對比化療前后外周血cf-DNA水平的下降程度進一步評估治療效果，為臨床工作提供了另一種思路。

本研究結果顯示，MM組化療效果好的患者化療后外周血cf-DNA水平較低，與文獻[15]對淋巴瘤的相關報道類似，提示臨床工作者可以通過外周血cf-DNA水平判斷MM患者化療效果。

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