微流控芯片技術在血腦屏障模型構建中的應用進展

杜萌，鄭國俠，王云華

(大連大學，遼寧大連 116622)

血腦屏障(BBB)包括血-腦、血-腦脊液屏障、腦脊液-腦屏障，是由腦內的血管內皮細胞以及星型膠質細胞、周細胞、基底膜共同構成的致密屏障結構。BBB既可以充當物理和功能屏障調節被動、主動運輸，也可以充當新陳代謝和免疫屏障[1,2]，對于維持中樞神經系統(CNS)內環境的穩定起到十分重要的作用，但BBB的存在也使得98%的小分子物質以及幾乎100%的大分子物質不能進入CNS發揮作用。傳統的體外BBB模型大致經歷了腦微血管碎段模型[3]、體外細胞培養模型(包含單一微血管內皮細胞培養模型[4]及血管內皮細胞、星型膠質細胞共培養模型[5]和血管內皮細胞、星型膠質細胞、周細胞共培養模型[6])和3D動態BBB模型[7,8]三個階段。傳統的體外BBB模型多以Transwell小室為載體進行靜態培養，無法再現流體動力學數據。微流控芯片技術又稱芯片實驗室，是采用微細加工技術，將生物、化學、醫學等領域涉及的樣品預處理、分離、稀釋、反應、檢測等操作集中到一塊微米尺度的芯片上[9]。微流控芯片以微米通道為結構基礎，以取代常規生物或化學實驗室功能為目標，是交叉學科的杰出產物，涉及醫學、生物、化學、流體、電子、機械、材料等研究領域，成為了上個世紀90年代影響最為深遠的重大科學技術之一?，F就微流控芯片技術在BBB模型構建中的應用進展情況做一綜述。

1 微流控芯片技術的特點

根據實驗目的、實驗材料的不同，微流控芯片主要包括紙芯片[10]、通道式微流控芯片[11]、數字微流控芯片[12]三大分支。上世紀80年代末至90年代末，尤其是在研究芯片襯底的材料科學和微通道的流體移動控制技術得到發展后，微流控技術也取得了較大的進步。以玻璃為基質或玻璃與高分子聚合并重的通道式微流控芯片是目前研究最多的芯片之一。用于制作微流控芯片的材料有單晶硅、玻璃、石英和有機聚合物，如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、環氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯(PC)等。PDMS作為一種高分子有機硅化合物，具有良好的化學惰性、透光性、無毒、電絕緣等特點，常被用來與玻璃結合制作微流控芯片。微流控芯片上微通道的制作起源于制作半導體及集成電路芯片中使用的光刻和蝕刻技術，以此技術為基礎，根據實驗需要在基底材料上刻蝕出不同的通道圖案，并結合高分子聚合物材料是目前主流芯片制作方法[13]。微流控芯片技術迅猛發展，研究人員已經能夠實現在芯片上進行多種人體器官模型的構建，包括芯片血管[14]、芯片肺[15]、芯片心臟[16]、芯片肝[17]等。器官芯片不僅帶來了研究設備尺寸上的變化，而且在微環境模擬和器官性能模擬上也有眾多優點：①提供三維的細胞生長空間；②對細胞施加流體剪切力刺激或模擬人體動態的機械應力，如呼吸時肺組織的牽拉與擠壓力、血壓等；③即時供給營養，排出代謝廢物；④透明的芯片使實驗結果觀測更容易。

2 微流控芯片技術在BBB模型構建中的應用

由于動物研究不能夠提供大量平行可控的、相似的內環境用于定量研究，且傳統的體外BBB模型具有流體不可控等缺點，所以自20世紀90年代微流控技術問世以來研究人員積極將其用于體外BBB模型的構建，現根據屏障結構的細胞組成不同分為單一內皮細胞模型及內皮細胞、星型膠質細胞共培養模型和內皮細胞、星型膠質細胞、周細胞共培養模型。

2.1 單一內皮細胞模型 永生化人腦微血管內皮細胞hCMEC/D3可以穩定表達內皮細胞特異性標志物CD31、VE-cadherin、von Willebrand等，且能夠表現出BBB特性，例如有形成緊密連接蛋白和排出藥物的能力。將hCMEC/D3單獨培養在Transwell小室中或培養于微流控芯片中，其跨內皮電阻值(TEER)大于原代血管內皮細胞與星型膠質細胞共培養所達到的TEER[18]。Griep等[19]將hCMEC/D3培養于芯片中構建了一種微流控芯片BBB模型，使用Transwell小室的PC膜(厚度10 μm，孔徑0.4 μm)模擬基底膜，將其封接在兩層PDMS中間，上下兩層通道分別模擬BBB的內外兩側，結果顯示hCMEC/D3在芯片中培養至第4天可形成緊密連接蛋白ZO-1。Transwell小室構建的BBB模型在第7天時TEER值為(28.2±1.3)Ω·cm2，而微流控BBB模型為(36.9±0.9)Ω·cm2，當細胞在流體作用下培養時TEER可達到120 Ω·cm2。TNF-α影響屏障完整性實驗結果顯示，當用濃度為1 ng/mL的TNF-α處理細胞2 h，TEER短時間內從120 Ω·cm2降至20 Ω·cm2，證明了屏障結構的完整性。

Kim等[20]使用3D打印機打印出外部框架結構，將Ⅰ型膠原蛋白置入其中，并嵌入微針形成4個直徑為235 μm或360 μm的柱型孔，構建了一種體外腦微血管模型。在管腔內側注入鼠腦內皮細胞bEnd.3，檢測發現bEnd.3培養14 d后已表達ZO-1。在培養了1、2、3、4、7、14、21 d后分別注入分子量為40 kD的異硫氰酸熒光素-右旋糖苷(FITC-dextran)，結果顯示熒光素的滲透率隨培養天數的增加而減少，高滲物質甘露醇的注入能顯著增加熒光素的滲透，繼續培養4 d后膜滲透率逐漸恢復到較低水平，這些特性都與在體BBB屏障的生理特性一致。

由于目前國際上并沒有關于構建微流控BBB模型的標準，所以即使是用同一種細胞系構建的微流控BBB模型，在TEER、滲透系數等方面都存在差異，是否考慮到流體剪切力對屏障結構的影響也會對實驗結果產生影響。

2.2 內皮細胞、星型膠質細胞共培養模型 Panula等[21]首次證實了從動物體內分離的腦內皮細胞可以作為體外培養的BBB原型，但是隨著時間的推移，內皮細胞逐漸喪失了許多體內特性，當與星型膠質細胞共培養或在星型膠質細胞條件培養基中培養時，內皮細胞再次表現為廣泛的纖維連接蛋白形成和低滲透率，提示體內固有環境因素，尤其是細胞間的相互接觸對細胞分化和增殖的重要影響。

Booth等[22]構建的內皮細胞與星型膠質細胞共培養的芯片中，PC膜用于模擬基底膜結構，上下兩側的PDMS分別刻有細胞培養室。在膜上下培養室分別培養鼠內皮細胞bEnd.3和鼠星型膠質細胞C8D1A。3 d后bEnd.3表達ZO-1，C8D1A表達神經膠質細胞特異性標志物GFAP。TEER測量結果顯示芯片BBB模型可達到250 Ω·cm2，Transwell僅為25 Ω·cm2。且在這兩種模型中，內皮細胞與膠質細胞共培養所達到的TEER均大于內皮細胞單獨培養。在芯片中分別注入不同濃度的組胺后，TEER出現不同程度的下降，并于數分鐘后恢復到正常水平。碘化丙錠及不同分子量大小(4、2、70 kD)的FITC-dextran，評價膜滲透性結果顯示顆粒直徑越小的熒光示蹤物越容易透過滲透膜，且共培養體系較單獨培養內皮細胞具有更低的滲透性。

以上實驗證實，基于內皮細胞與膠質細胞共培養所構建的芯片BBB模型具有更高的TEER、低滲透性和能夠特異性表達BBB生理結構等特點，是對單一內皮細胞模型的補充與完善，可被用于檢測屏障功能在不同環境下的變化情況，例如屏障增強或屏障開放藥物，也可以通過滲透測定系統預測新藥的運送速率。

2.3 內皮細胞、星型膠質細胞、周細胞共培養模型 Brown等[23]構建了一種四層結構式芯片，在星型膠質細胞的培養室中實現了原代人腦微血管內皮細胞hBMVEC、原代星型膠質細胞、原代周細胞、IPS誘導的神經元細胞共培養，證實星型膠質細胞條件培養基和周細胞條件培養基能夠促進緊密連接蛋白的形成。BBB形成的另一個重要特性是在流動方向上的內皮細胞極化，因此Brown等驗證了不同培養條件對內皮細胞極化的影響。結果顯示，維持在無血清培養基中的內皮細胞幾乎沒有任何肌動蛋白束的形成；單獨培養條件下，65%肌動蛋白纖維形成方向與液體流動方向一致，隨著周細胞條件培養基的增加，這個數字增至78%；有趣的是，星型膠質細胞條件培養基的增加會促進垂直于流體方向肌動蛋白纖維的極化。這些結果表明，流體、血清、星型膠質細胞和周細胞所產生的某些因子是成熟BBB形成的重要因素。內皮細胞、星型膠質細胞、周細胞共培養模型考慮到了BBB形成過程中的環境因素和重要細胞類型，是目前微流控芯片BBB模型中較為完善的一種。

綜上所述，微流控芯片不僅可以實現細胞的三維生長，而且可以人為控制液體的流動方向，實現體內優勢與體外優勢的結合[24]，成為研究體外微流控BBB模型的有力工具。未來微流控芯片BBB模型將可以用來研究藥物滲透性對神經元的影響，也可以與不同的神經系統疾病模型進行整合，從藥代動力學出發研究藥物滲透過BBB后對不同疾病的治療效果，這將是微流控芯片BBB模型未來研究的重要方向。